Vero 숙주 세포 DNA 잔류물 검출 키트는 다양한 생물학적 제품의 중간 시료, 반제품 및 완제품에 존재하는 Vero 숙주 세포 DNA 잔류물을 정량적으로 분석하는 데 사용됩니다.

이 키트는 Taqman 형광 프로브와 중합효소 연쇄 반응(PCR) 방법을 채택하는데, 이는 fg 수준의 최소 검출 한계를 가지고 있으며 잔류 Vero 세포 DNA를 특이적이고 빠르게 검출할 수 있습니다. 이 키트는 잔류 DNA 샘플 준비 키트(Cat# 18461ES)와 함께 사용해야 합니다.

제품 구성 요소

^* IC：내부통제

배송 및 보관

1. 건조 얼음에 담아 배송하고 -20°C에서 2년간 보관

2. 상품을 받으신 후 즉시 확인하시고 해당 보관온도에 맞춰 보관해 주시기 바랍니다.

주의사항

1. 본 시약을 사용하기 전에 본 설명서를 주의 깊게 읽고, 시료 취급, 반응 시스템 제조 및 시료 첨가를 포함하여 실험을 표준화해야 합니다.

2. 샘플을 추가하고 용액을 준비하는 작업은 얼음 위에서 하는 것이 가장 좋습니다.

3. 사용하기 전에 각 구성 요소가 완전히 진탕되고 저속으로 원심분리되었는지 확인하십시오.

4. 안전과 건강을 위해 작업 시에는 실험실 가운과 일회용 장갑을 착용해 주시기 바랍니다.

5. 이 제품은 연구용으로만 사용하세요!

적용 가능한 계기 모델

다음을 포함하되 이에 국한되지 않습니다.

Bio-Rad: CFX96 광학 모듈.

Thermo Scientific: ABI 7500; ABI Quant Studio 5; ABI Step OnePlus.

사용 설명서

1. Vero DNA 표준 희석 및 표준 곡선 준비

Vero DNA Control은 키트에 제공된 DNA 희석 완충액을 사용하여 기울기 희석하였고, 희석 농도는 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL, 30 fg/μL, 3 fg/μL입니다.

자세한 지침은 아래를 참조하세요.

1.1 Vero DNA 대조군과 DNA 희석 완충액을 얼음 위에서 녹입니다. 완전히 녹인 후, 부드럽게 흔들어 섞고, 저속으로 10초 동안 원심분리합니다.

1.2 3 ng/μL이라고 표시된 깨끗한 1.5 mL 튜브 6개(①, ②, ③, ④, ⑤, ⑥)를 꺼냅니다.

1.3 3 ng/μL로 표시된 1.5 mL 마이크로퓨지 튜브에 90 μL DNA 희석 완충액과 10 μL Vero DNA Control을 넣고 3 ng/μL로 희석합니다. 섞은 다음 10초 동안 원심분리합니다. 희석된 DNA 표준을 하위 포장하면 단기적으로(최대 3개월) -80°C에서 보관할 수 있습니다. 반복적인 동결-해동은 피하십시오.

1.4 다른 튜브에 DNA 희석 완충액 90 μL를 넣은 다음, 아래 연속 희석 절차를 따릅니다.

[참고사항]:

1. 각 농도에 대해 3개의 복제 웰이 필요합니다. 검출 범위는 3 fg/μL-300pg/μL이며, 필요한 경우 이 범위를 확장할 수 있습니다.

2. 반복적인 동결-해동 횟수를 줄이고 오염을 피하기 위해, DNA 대조군을 처음에는 -80°C에서 일정량으로 보관하는 것이 좋습니다.

3. DNA 희석 완충액은 해동 후 2-8°C에서 7일간 보관이 가능하며, 장기간 사용하지 않을 경우 -20°C에서 보관하시기 바랍니다.

4. 템플릿이 완전히 혼합되었는지 확인하고, 각 그라데이션 희석마다 15초~1분 동안 혼합물을 가볍게 흔듭니다.

2. 추출 회수 제어(ERC) 준비

필요에 따라 ERC의 Vero DNA 농도를 설정합니다(ERC 샘플은 예시로 3 pg/μL DNA로 준비됨). 다음과 같습니다.

2.1 깨끗한 1.5 mL 튜브에 100 μL의 시험 시료를 넣은 다음, 10 μL의 3pg/μL Vero DNA Standard(③)를 첨가하고 잘 섞은 후 ERC로 표시합니다.

2.2 정제된 ERC 샘플을 준비하기 위해 시험 샘플과 함께 ERC 샘플의 DNA 추출을 수행합니다.

3. 양성대조검체(PCS) 준비(선택사항)

필요에 따라 PCS의 Vero DNA 농도를 설정합니다(예시로 PCS는 3 pg/μL DNA로 준비됨). 다음과 같습니다.

3.1 깨끗한 1.5 mL 튜브에 3 pg/μL Vero DNA Standard(③) 100 μL를 넣은 후 PCS로 표시합니다.

3.2 정제된 PCS를 준비하기 위해 시험 샘플과 함께 PCS의 DNA 추출을 수행합니다.

4. 음성대조액(NCS) 제조

실험에서 음성 대조군을 설정합니다. 구체적인 작업 단계는 다음과 같습니다.

4.1 깨끗한 1.5mL 튜브에 100 μL 샘플 매트릭스(또는 DNA 희석 완충액)를 넣은 다음 NCS로 표시합니다.

4.2 정제된 NCS 샘플을 준비하기 위해 시험 샘플과 함께 NCS 샘플의 DNA 추출을 수행합니다.

5. 템플릿 컨트롤(NTC) 준비 없음

실험에서 템플릿 없는 제어를 설정합니다. 구체적인 작업 단계는 다음과 같습니다.

5.1 NTC는 샘플 전처리가 필요 없으며 잔류 DNA 함량을 검출하는 qPCR 단계에서 구성될 수 있습니다.

5.2 각 튜브 또는 웰의 NTC 샘플은 20 μL 혼합물(즉, 16 μL Vero qPCR 혼합물 + 4 μL Vero Primer&probe 혼합물) + 20 μL DNA 희석 완충액입니다. 3개의 복제 웰을 구성하는 것이 좋습니다.

6. PCR 반응 시스템

[참고사항]:

1. 반응 수로 총 PCR 반응 부피를 계산합니다. qPCR Mix = (반응 수+2) × (16+4) μL(두 반응 웰의 손실 포함). 실험에서는 각 샘플에 대해 3회 이상의 반복이 권장됩니다.

2. 튜브를 캡핑하거나 플레이트를 밀봉한 후 반응 튜브 또는 플레이트를 저속으로 10초 동안 원심분리합니다. 5초 동안 충분히 흔들고 섞은 후 원심분리를 반복하여 뚜껑이나 벽에서 바닥까지 액체를 수집합니다. 작동 중에 거품이 생기지 않도록 합니다.

권장되는 플레이트 설정은 아래 표를 참조하세요.

플레이트 레이아웃에는 다음이 포함됩니다. 1 NTC(템플릿 없는 대조군), 1 NCS(음성 대조군 용액), 6 STD(6가지 표준 농도의 표준 곡선), 3 TS(테스트 샘플), 3 ERC(추출 회수 대조군), 1 PCS(양성 대조군 샘플). 각 샘플에 대한 3개의 복제 웰.

7. PCR 장비 설정 지침(2단계 방법)

다음 지침은 Thermo ABI 7500 qPCR 기기(소프트웨어 버전 2.0)에만 적용됩니다. 다른 기기를 사용하는 경우 해당 기기 가이드에서 설정 지침을 참조하세요.

7.1 새로운 실험을 생성하고 절대 정량화 또는 사용자 정의 템플릿을 선택합니다.

7.2 '정의' 인터페이스와 '대상' 창에서 대상을 추가하고 FAM으로 이름을 지정한 후, 리포터를 'FAM'으로, 퀀처를 '없음'으로 선택합니다.

7.3 '샘플' 창에서 모든 샘플 정보를 차례로 추가합니다. 그런 다음 웰을 선택하고 대상과 샘플을 각각 선택합니다. Vero DNA 표준의 작업을 표준으로 설정하고 수량 열에 300000, 30000, 3000, 300, 30, 3(각 웰의 DNA 농도 단위는 fg/μL) 값을 할당하고 웰의 이름을 STD 1, STD 2, STD 3, STD 4, STD 5, STD 6으로 지정합니다. NTC의 작업을 NTC로 설정합니다. NCS, TS, ERC 및 PCS를 알 수 없음으로 설정하고 위의 플레이트 레이아웃에 따라 각각 이름을 지정합니다. 그런 다음 다음을 클릭합니다.

7.4 증폭 프로그램을 설정합니다: 반응 용량을 40 μL로 설정합니다.

8. qPCR 결과 분석

8.1 시스템은 자동으로 분석의 Amplification Plot 패널에서 Threshold를 제공합니다. 시스템에서 제공하는 Threshold는 때때로 기준선에 너무 가까워서 반복 웰 간 Ct에 큰 차이가 발생합니다. Threshold를 적절한 위치로 수동으로 조정하고 Analyze를 클릭할 수 있습니다. 그런 다음 Multicomponent Plot에서 증폭 곡선이 정상인지 처음에 확인할 수 있습니다.

8.2 결과 분석 탭에서 표준 곡선 플롯을 검토합니다. 기울기, Y 절편, R2 및 효율성에 대한 값을 확인합니다. 정규 표준 곡선의 경우 R²>0.99; 90%≤Eff%≤110%.

8.3 분석의 '웰 테이블 보기' 창에서 각 샘플의 농도가 수량으로 표시되며, 단위는 fg/μL입니다. 이 단위는 분석 보고서에서 pg/μL 또는 pg/mL로 변환할 수 있습니다.

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