설명
반응성 산소 종 검정 키트는 세포 투과 시약인 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCFDA)를 사용하여 생세포 샘플에서 반응성 산소 종을 정량적으로 평가합니다. 친유성 비형광 DCFDA는 수동 확산을 통해 세포막을 쉽게 통과한 다음 탈아세틸화됩니다. 탈아실화된 제품은 산화제에 민감한 2',7'-디클로로플루오레신(DCHF)입니다. DCHF는 나중에 ROS에 의해 산화되어 DCF를 형성합니다. DCF는 형광성이 매우 강하며 여기/방출이 480nm/525nm인 형광 분광법 또는 유세포 분석법으로 검출합니다. 화합물 혼합물인 Rosup은 ROS 유도제이며 양성 대조군으로 사용할 수 있습니다.
제품 구성 요소
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구성품 번호 |
구성 요소 |
수량 |
저장 |
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50101-A |
DCFH-DA(10mM) |
100µL |
영하 20도 |
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50101-B |
로스프(100mM) |
1ml(1ml) |
영하 20도 |
배송 및 보관
이 키트는 얼음 주머니와 함께 제공됩니다. -20°C에서 1년간 빛 없이 보관하십시오. 반복적인 동결 및 해동은 피하십시오.
적용방법
1. 시약 준비
DCFH-DA 용액: 개봉하기 전에 저속으로 잠깐 원심분리합니다. 혈청이 없는 배지에서 10 mM DCFH-DA를 희석하여 최종 농도가 10 μM이 되도록 하여 작동하는 DCFH-DA 용액을 준비합니다.
[참고]: DCFH-DA는 페놀 레드가 없는 배지에서도 희석할 수 있습니다. 신선하게 제조한 DCFH-DA 용액을 사용하고, 희석된 DCFH-DA의 장기 보관은 권장하지 않습니다. 필요한 DCFH-DA의 정확한 농도는 사용하는 세포주에 따라 달라지지만 일반적인 시작 범위는 10-50 μM입니다. 특정 세포의 경우 음성 대조군(DCFH-DA 프로브 없음)의 형광이 매우 강하면 DCFH-DA를 2-5 μM으로 희석하고 배양 시간을 적절히 단축합니다.
Rosup 용액: 혈청이 없는 배지에서 100 mM Rosup 스톡 용액을 희석하여 100 µM Rosup 작업 용액을 준비합니다. 일반적으로 어두운 곳에서 37℃에서 30분~4시간 동안 Rosup과 함께 배양하면 ROS가 상당히 증가할 수 있습니다.
[참고]: Rosup의 배양 시간은 세포주의 민감도에 따라 달라집니다. 예를 들어, Hela의 경우 30분, MRC5의 경우 1.5시간입니다. 30분 이내에 ROS 증가가 관찰되지 않으면 유도 시간 또는 농도를 적절히 늘릴 수 있습니다. ROS가 너무 빨리 증가하면 유도 시간 또는 농도를 적절히 줄일 수 있습니다.
약물: 관심 있는 약물을 10% FBS 또는 기타 적절한 용액이 포함된 완전배지에서 원하는 농도로 조제합니다.
2. 부착세포에 대한 권장 프로토콜
a) 세포 준비: 실험 전날 표준 세포 배양 배지에서 부착 세포를 배양하여 실험 당시 세포 밀도가 70%에 도달하도록 합니다.
b) 약물 유도: 배지를 제거합니다. 각 웰을 미리 준비한 혈청이 없는 희석된 약물로 덮고 어둠 속에서 37°C에서 원하는 시간 동안 배양합니다.
c) (선택 사항) 양성 대조군: 양성 대조군 웰 위에 미리 준비한 Rosup 용액을 덮고 어둠 속에서 37°C에서 원하는 시간 동안 배양합니다.
[주의]: 자극 시간이 짧은 세포(일반적으로 2시간 이내)의 경우 프로브를 먼저 로드한 후 Rosup이나 관심 약물을 추가할 수도 있습니다.
d) ROS 프로브 로딩: 모든 배지를 제거하고 혈청이 없는 배지로 세포를 1-2회 세척합니다. 각 웰을 이전에 준비한 DCFH-DA 용액으로 덮습니다. 37℃에서 30분 동안 어둠 속에서 배양합니다.
e) 배지를 제거하고, 혈청이 없는 배지로 세포를 1~2회 세척하여 유리 DCFH-DA를 제거합니다.
3. Suspension Cell에 대한 권장 프로토콜
a) 세포 준비: 실험 당일에 현탁 세포를 웰당 약 1.5 × 105개 세포로 배양합니다.
b) 약물 유도: 원심분리하여 원뿔형 튜브에 세포를 수집하고, 이전에 준비한 혈청이 없는 희석된 약물의 적절한 양에 현탁시키고, 어둠 속에서 37°C에서 원하는 시간 동안 배양합니다.
c) (선택 사항) 양성 대조군: 이전에 준비한 Rosup 용액으로 양성 대조군 세포를 현탁시키고 어둠 속에서 37°C에서 원하는 시간 동안 배양합니다.
d) ROS 프로브 로딩: 새 튜브에 수집하고 PBS에서 두 번 원심분리하여 세포를 세척합니다. 세포 밀도가 1×106-2×107/mL인 이전에 준비한 DCFH-DA 용액으로 세포를 재현탁합니다. 그런 다음 어둠 속에서 37℃에서 30분 동안 배양합니다. 프로브와 세포가 완전히 접촉하도록 3-5분마다 튜브를 뒤집습니다.
[주의]: 세포 밀도는 이후 검출 방법에 따라 조정해야 합니다. 예를 들어, 유세포 분석의 경우 단일 튜브의 세포 수는 104/mL 미만이거나 106/mL 초과해서는 안 됩니다.
e) 혈청이 없는 배지로 2번 원심분리하여 세포를 수집하고 세척하여 유리 DCFH-DA를 제거합니다.
4. 형광 검출 및 데이터 분석
형광 현미경 측정: 형광 현미경을 사용하여 플루오레세인(FITC)에 적합한 필터 세트로 생세포 현미경을 수행합니다. 시각적으로 밝기에 대한 세포의 점수를 매기고 대조군과 샘플을 비교하거나 이미지 분석 방법을 사용하여 세포의 디지털 사진 간의 신호를 비교합니다.
유세포 분석 측정: 부착 세포는 트립신으로 수집하여 단일 세포 현탁액을 준비해야 합니다. 현탁 세포의 경우 세포를 직접 수집합니다. 이상적으로는 실험 조건당 10,000개의 세포를 분석해야 합니다. 실험 중 세포가 지나치게 농축되어서는 안 됩니다(<1 ×106 cells/mL). 잔해물을 제거하고 게이팅을 사용하여 관심 있는 세포 집단을 분리합니다. 평균 형광 강도를 사용하여 Ex/Em = 480/525 nm로 대조군과 처리된 샘플 간의 배수 변화를 확인합니다.
형광 마이크로플레이트 측정: 배지가 있는 상태에서 End Point 모드에서 Ex/Em = 480/525 nm에서 형광 플레이트 리더로 플레이트를 즉시 측정합니다. 모든 측정에서 공백 판독값을 빼고 검정 대조군에서 폴드 변화를 결정합니다.
주의사항
1. DCFH-DA로 배양한 후 세포를 씻어서 배경 노이즈를 줄입니다.
2. 가능한 한 빨리 배양 후 형광을 측정하여 오류를 방지하는 것이 좋습니다.
3. 귀하의 안전과 건강을 위해 수술 시에는 실험실 가운과 일회용 장갑을 착용해 주시기 바랍니다.
4. 연구 목적으로만 사용하세요!
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