푸로마이신은 스트렙토마이세스 알보니거의 발효 및 대사에 의해 생성되는 아미노글리코사이드계 항생제로, 단백질 합성을 억제하여 그람 양성균, 다양한 동물 및 곤충 세포를 죽입니다. 푸로마이신은 어떤 경우에는 대장균에 효과적입니다. 그 메커니즘은 푸로마이신이 아미노일-TrNA 분자의 3' 말단의 유사체로, 리보솜의 A 부위에 결합하여 연장된 펩타이드 사슬에 통합될 수 있다는 것입니다. 푸로마이신이 A 부위에 결합한 후에는 후속 반응에 참여하지 않아 단백질 합성이 조기에 종료되고 C 말단에 푸로마이신이 포함된 미성숙 폴리펩타이드가 방출됩니다.

퓨로마이신 생산 박테리아의 Streptomyces alboniger에서 발견되는 pac 유전자는 퓨로마이신 N-아세틸트랜스퍼라제(PAC)를 인코딩하는데, 이는 퓨로마이신에 대한 내성을 부여할 수 있습니다. 이 특징은 현재 pac 유전자를 지닌 플라스미드를 지닌 특정 포유류 안정적으로 형질 전환된 세포 균주를 스크리닝하는 데 일반적으로 적용됩니다.

세포 안정 균주 스크리닝에서 푸로마이신의 일반적인 사용은 렌티바이러스 벡터의 특성과 관련이 있으며, 대부분의 상업용 렌티바이러스 벡터는 현재 pac 유전자를 가지고 있습니다. 일부 특정한 경우에 푸로마이신은 pac 유전자 플라스미드를 가지고 있는 변형된 E. coli 균주를 스크리닝하는 데에도 사용될 수 있습니다.

본 제품은 멸균된 퓨로마이신 염산염 용액으로 증류수에 용해한 것이며, 농도는 10 mg/mL(H2O에 10 mg/mL ₎ 입니다 . 세포 배양에 적합한 배지나 다른 완충액으로 직접 희석할 수 있으며, 일반적인 작업 농도는 1-10 µg/mL입니다.

또한, Yeasen 회사는 분말 형태의 푸로마이신 염산염(제품번호 60210ES)도 제공하는데, 이는 형태는 다르지만 기능은 동일합니다.

특징

순도 ≥ 98%

멸균

응용 프로그램

세포배양에 적합

pac 유전자를 운반하는 플라스미드를 운반하는 S creen 특정 포유류 안정적으로 형질 전환된 세포 균주

pac 유전자 플라스미드를 함유하는 형질전환된 대장균주를 스크리닝 한다 .

명세서

구성 요소

배송 및 보관

푸로 마이신 (용액 중 10 mg/mL) 제품은 -15℃ ~ -25℃에서 1 년간 보관 가능합니다 .

지침

1. 제안된 작업 집중도

포유류 세포: 1-10 μ g/mL, 최적 농도는 사멸곡선을 통해 결정되어야 합니다.

대장균: LB 아가배지를 사용하여 125 μ g/mL 농도의 pac 유전자로 안정적으로 형질전환된 대장균을 스크리닝했습니다 .

참고사항 : 퓨로마이신을 사용하여 안정한 대장균 균주를 스크리닝하려면 정확한 pH 조정이 필요합니다.

푸로마이신 염산염 의 권장 농도

2. 푸로마이신 사멸 곡선 결정 (shRNA 형질감염 또는 렌티바이러스 형질 도입을 예로 들어)

퓨로마이신 의 효과적인 스크리닝 농도는 세포 유형, 성장 상태, 세포 밀도, 세포 대사 및 세포 주기 위치와 관련이 있습니다. 안정적으로 발현되는 shRNA 세포주를 스크리닝하려면 형질감염되지 않은/형질감염된 세포를 죽이는 퓨로마이신의 최소 농도를 결정하는 것이 중요합니다. 처음으로 실험을 하는 고객은 자신의 실험 시스템에 적합한 킬 곡선을 수립하는 것이 좋습니다.

1) 1일차: 24-well 플레이트를 5 - 8 × 104 cells/well 의 밀도로 도말하고 , 이후 의 기울기 실험을 위해 충분한 수의 well을 도말합니다. 세포는 37 ℃ 에서 하룻밤 배양합니다 .

2) 2일차: A) 스크리닝 배지를 준비합니다: 퓨로마이신의 다양한 농도(예: 0~15 μ g/mL, 최소 5단계 기울기)를 함유한 새로운 배지를 준비합니다. B) 하룻밤 배양 후 세포에 새로 준비한 스크리닝 배지를 교체합니다. 그런 다음 세포를 37 ℃ 에서 배양합니다 .

3) 4일차: 새로운 선택 배지로 교체하고 세포 생존력을 관찰합니다.

4) 세포의 성장 상태에 따라 2~3일마다 새로운 선택배지로 교환합니다.

5) 항생제 스크리닝을 시작한 후 4~6일 이내에 비전형 세포나 모든 비전형 세포를 죽이는 데 효과적인 약물의 최저 농도를 결정하기 위해 생존 가능한 세포의 비율을 관찰하기 위해 매일 세포를 모니터링했습니다.

3. 포유류 안정형 형질전환 세포주 스크리닝

pac 유전자를 포함하는 플라스미드를 형질감염시킨 후, 퓨로마이신을 포함하는 배지에서 세포를 증식시켜 안정적인 형질감염체를 선택했습니다.

1) 형질감염 48시간 후, 세포(원래 세포 또는 희석된 세포)를 적절한 농도의 퓨로마이신이 포함된 신선한 배지에서 배양합니다.

참고 : 항생제는 세포가 활발하게 분열할 때 가장 효과적입니다. 세포가 너무 조밀하면 항생제의 효과가 크게 감소합니다. 세포를 25% 이하의 밀도로 플레이팅하는 것이 가장 좋습니다.

2) 퓨로마이신이 함유된 배양배지는 2~3일마다 제거하고 교체하세요.

3) 세포 형성 초점은 스크리닝 후 7일 후에 평가됩니다. 병변은 숙주 세포주와 형질감염 스크리닝 효율에 따라 추가로 1주일 이상 필요할 수 있습니다.

참고: 매일 세포 성장 상태를 관찰하십시오. 푸로마이신 스크리닝에는 최소 48시간이 필요하며, 푸로마이신의 유효 농도 스크리닝 기간은 일반적으로 3-10일입니다.

4) 5-10개의 내성 클론을 35mm 페트리 접시에 옮겨 놓고 7일 동안 선택 배지로 계속 배양합니다. 이 농축 배양은 미래의 세포독성 실험을 준비하기 위한 것입니다 .

서류:

안전 데이터 시트

60209 _MSDS_HB22042 0 _EN.pdf

매뉴얼

60209 _설명서_HB2 5 011 4 _EN.pdf

인용 및 참조:

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