G418 황산염은 제네티신 황산염으로도 알려져 있으며, 아미노글리코사이드 항생제이며 젠타마이신 B1과 구조적으로 유사합니다. 80s 리보솜에 결합하여 연장 단계를 차단함으로써 단백질 합성을 방해합니다. G418 황산염은 박테리아, 효모, 고등 식물 및 포유류 세포, 원생동물 및 벌레를 포함한 원핵 및 진핵 세포 모두에 독성이 있습니다. 트랜스포존 Tn601(903) 또는 Tn5에 위치한 내성 유전자(주로 neo)는 박테리아에서 유래하지만 진핵 세포에서 발현될 수 있습니다. 내성 유전자는 유전자 재조합 기술을 통해 세포에 도입하여 G418 내성을 얻을 수 있으며, 이는 내성 유전자를 지닌 원핵 또는 진핵 세포의 배양을 스크리닝하고 유지하는 데 사용될 수 있습니다.

포유류 세포에서 neo는 진핵 생물 게놈에 통합된 후 아미노글리코사이드 3'-포스포트랜스퍼라제(APH(3') II)의 발현을 인코딩합니다. 이 효소는 G418의 아미노 또는 하이드록실 기능을 공유적으로 변형하고 항생제-리보솜 상호작용을 억제하여 항생제를 불활성화하고 세포에 G418 내성을 부여합니다. 안정된 세포주 실험을 스크리닝할 때, 비내성 세포를 죽이는 데 필요한 최소 유효 농도를 결정하기 위해 사멸 곡선(용량-반응 곡선)을 확립해야 합니다.

식물 세포에서 내성은 nptII 유전자 내성 플라스미드를 형질감염시켜 얻을 수 있습니다. nptII 유전자는 또한 G418, 카나마이신, 팔로마이신을 포함한 여러 항생제를 불활성화하는 효소인 아미노글리코사이드 인산전달효소를 인코딩합니다.

특징

순도 ≥ 98%

공장 대량 생산 방식을 이용한 표준화된 생산

분자생물학 및 조직배양의 생화학 실험연구 분야에 활용 가능한 광범위한 응용분야

협력 플랫폼은 전체를 포괄합니다

제품 품질 안정성을 확보하기 위해 배치 간 차이는 1% 이내로 관리됩니다.

응용 프로그램

안정적으로 형질전환된 세포주 스크리닝

명세서

구성 요소

배송 및 보관

G418 Sulfate(Geneticin) 제품은 -15℃ ~ -25℃에서 3 년간 보관 가능합니다 .

지침

1. G418 보관용액(50 mg/mL, 활성농도) 제조

1) 활동단위 변환

변환은 다음 공식에 따라 수행되었습니다: (1000/A0) ×A1=A2

A0: G418의 효능 값은 배치마다 다릅니다. 배치 품질 보고서나 병의 라벨을 참조하세요.

A1: 원하는 활성 G418 농도.

A2: G418의 실제 농도.

예를 들어, 배치의 G418 활성 값이 750 U/mg이고 G418의 활성 농도가 50 mg/mL인 경우, 실제로 준비해야 할 분말 농도는 1000/750×50 mg/mL=66.67 mg/mL입니다. G418 보관 용액(활성 농도, 50 mg/mL) 10 mL을 준비한 경우, 분말 666.7 mg을 칭량해야 합니다.

2) 살균 및 보존

위의 변환을 통해 얻은 실제 분말을 달아서 멸균 탈이온수 10mL를 첨가하여 완전히 용해시킵니다.

0.22 μm 니들 필터를 멸균 탈이온수 5 mL로 미리 적신 다음 G418 용액을 여과하여 멸균합니다. 멸균된 G418 용액을 분주하여 -20℃에서 보관합니다.

주의: ① 탁한 용액은 여과하지 마십시오. 용액이 완전히 용해되지 않았기 때문에 여과 과정에서 약물 손실이 발생하고 최종 용액의 활성이 감소합니다. ② 배양 배지, 인산염 용액 또는 유기 용매를 사용하여 보관 용액을 제조하는 것은 권장되지 않습니다.

2. 일반적으로 사용되는 스크리닝 농도

일반적으로 트랜스포터를 스크리닝하기 위해서는 처음에 고농도의 G418이 필요하고, 배양을 유지하기 위해서는 저농도를 사용합니다. 성장 조건, 세포 유형 및 기타 환경 요인은 G418의 효과적인 복용량에 영향을 미칠 수 있으므로, 킬링 곡선(용량-반응 곡선)을 통해 최적의 스크리닝 농도를 결정하는 것이 좋습니다.

일반적으로 포유류 세포의 스크리닝 범위는 200~2000μg/mL, 식물 세포: 10~100μg/mL, 효모 세포: 500~1000μg/mL입니다.

세포주 실험 데이터

3. 킬링커브의 설정

참고: 표적 단백질을 안정적으로 발현하는 세포주를 스크리닝하기 위해서는 형질전환되지 않은 숙주 세포를 죽일 수 있는 항생제의 최소 농도를 결정해야 합니다. 이는 사멸 곡선(용량-반응 곡선)을 수립하여 달성할 수 있습니다. 최소 6가지 농도를 선택해야 합니다. G418은 체세포 분열 세포를 처리할 때 가장 활성이 높으므로 G418을 첨가하기 전에 일정 기간 동안 세포를 배양해야 합니다.

1) 1일차 : 형질전환되지 않은 세포를 37℃에서 세포 밀도가 20-25%인 적절한 배양판에 놓고 CO ₂ 에서 밤새 배양합니다 .

참고사항: 생존력을 확인하기 위해 더 높은 밀도가 필요한 세포의 경우 접종량을 늘릴 수 있습니다.

2) 세포 유형에 따라 적절한 범위 내에서 G418 농도 구배를 설정합니다. 포유류 세포는 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL로 설정할 수 있습니다.

3) 2일차: 오래된 배지를 제거하고 해당 농도의 약물을 함유한 새로 준비한 배지로 교체합니다. 각 농도에 대해 평행하게 3개를 만듭니다.

4) 3~4일마다 G418이 함유된 새로운 배지로 교체하세요.

5) 살아있는 세포 계수는 적절한 농도를 결정하기 위해 고정된 주기(예: 2일마다)로 수행됩니다. 안정적인 형질감염 세포 스크리닝을 위한 작업 농도로, 이상적인 일수(일반적으로 7-10일) 내에 대부분의 세포를 죽이는 최소 농도를 선택합니다.

4. 안정적인 형질전환 세포의 스크리닝

1) 형질감염 48시간 후, 적절한 농도를 함유한 G418 배양배지를 사용하여 계대배양(직접 계대배양 또는 희석 계대배양)을 실시했습니다.

참고사항: 좋은 스크리닝 결과를 얻으려면 세포 농도를 25% 이하로 희석하는 것이 좋습니다.

2) 약물이 들어 있는 스크리닝 매체는 3~4일마다 교체하세요.

3) 스크리닝 7일 후 세포 콜로니 형성을 측정합니다. 콜로니 형성은 숙주 세포 유형, 형질감염 및 스크리닝 효과에 따라 1주일 이상 걸릴 수 있습니다.

4) 5~10개의 내성 클론을 선택하여 35mm 세포 배양판에 옮긴 후, 약물이 함유된 스크리닝 배지에서 7일간 배양하였다.

5) 일반 매체로 교체하세요.

서류:

안전 데이터 시트

60220 _MSDS_HB22042 1 _EN.pdf

매뉴얼

60220 _설명서_HB2 5 011 5 _EN.pdf

그림

그림 1. 다양한 배치 간 genomicin의 유효 농도에 대한 안정성 시험 및 검증

실험균주 : 대장균

G69와 G99는 두 개의 다른 배치입니다

제노마이신의 사용 농도는 각각 8 mg/L, 12 mg/L 및 16 mg/L로 결정되었고, 효과적인 최소 농도는 16 mg/L로 결정되었으며, 이는 잡균의 성장을 완벽하게 억제했습니다. 두 배치의 성능은 일관되었습니다.