Streptomyces hygroscopicus가 합성한 아미노글리코사이드계 항생제인 히그로마이신 B는 70S 리보솜 전위를 방해하고 mRNA 템플릿의 오독을 유도하여 단백질 합성을 억제하고, 원핵생물(예: 박테리아), 진핵생물(예: 효모, 균류) 및 고등 포유류 진핵생물을 죽입니다.

대장균에서 유래된 히그로마이신 저항 유전자(hyg 또는 hph)는 히그로마이신 B 인산전달효소를 인코딩하는데, 이는 히그로마이신 B를 비생물학적으로 활성인 인산화된 생성물로 해독하여, 히그로마이신 저항 유전자로 성공적으로 형질감염된 원핵 또는 진핵 세포를 선별하고 배양하기 위한 탁월한 선택적 마커가 됩니다. 또한, 작용 모드가 다르기 때문에 히그로마이신 B는 종종 이중 저항 세포주를 선택하기 위해 G418 또는 블라스티시딘 S와 함께 사용됩니다. 히그로마이신 B는 바이러스 감염으로 인해 세포막 투과성이 증가한 세포에 선택적으로 침투하여 번역을 억제하기 때문에 항바이러스제로도 사용할 수 있습니다. 또한 동물 사료와 혼합하여 곤충 퇴치제로도 사용할 수 있습니다.

또한, Yeasen 회사는 용액 형태의 Hygromycin B(제품번호 60224ES)도 생산하는데, 이는 상태는 다르지만 기능은 동일합니다.

특징

공장 대량 생산 방식을 이용한 표준화된 생산

응용 프로그램

안정적으로 형질전환된 세포주 스크리닝

명세서

구성 요소

배송 및 보관

하이 그로마이신 B 제품은 -15 ℃ ~ -25 ℃ 에서 2 년간 보관 가능합니다 .

지침

1. 스톡 용액(50 mg/mL)의 제조

0.5g의 하이그로마이신 B를 달아서 10mL의 1 × PBS, pH 7.4에 첨가합니다. 완전히 용해시킨 후 0.22μm 필터로 여과하여 살균 합니다. 소량으로 나누어 한 번만 사용합니다(예: 1mL) -25~-15 ℃ 에서 보관 하거나 2 ~ 8 ℃ .

2. 일반적으로 사용되는 스크리닝 농도

안정한 전이 균주를 스크리닝하는 데 사용되는 하이그로마이신 B의 작업 농도는 세포 유형, 배지, 성장 조건 및 세포 대사율에 따라 달라야 하며, 권장 농도는 50-1000μg / mL입니다. 첫 번째 실험 시스템의 경우, 최적의 스크리닝 농도를 결정하기 위해 킬링 곡선(킬 곡선), 용량 반응성 곡선이 권장됩니다.

일반적으로 포유류 세포: 50~ 500μg /mL; 박테리아/식물 세포: 20~ 200μg /mL; 균류: 300~ 1000μg /mL.

3. 킬링커브의 설정

참고: 안정된 세포주를 스크리닝하기 위해서는 형질감염되지 않은 숙주 세포를 죽일 수 있는 항생제의 최소 농도를 결정해야 합니다. 이는 살상 곡선(용량-반응 곡선)을 설정하여 달성할 수 있습니다. 최소 5가지 농도를 배열해야 합니다.

1) 1일차: 형질전환되지 않은 세포를 20-25%의 세포 밀도로 적절한 배양판에 깔고 밤새 배양합니다.

참고사항: 활력을 감지하기 위해 더 높은 밀도가 필요한 세포의 경우 접종 세포의 양을 늘릴 수 있습니다.

2) 세포 유형에 따라 적절한 범위 내에서 농도 구배를 설정합니다. 포유류 세포는 50, 100, 250, 500, 750, 1000 μg /mL로 설정할 수 있습니다. 하이그로마이신 B 용액을 탈이온수 또는 PBS 완충액으로 1:10으로 희석하여 5 mg/mL로 만듭니다. 그런 다음 다음 표에 따라 용액을 해당 작업 농도로 희석합니다.

3) 2일차: 해당 농도의 약물을 함유한 신선하게 준비한 배지로 교체합니다. 각 농도에 대해 세 개의 평행 샘플을 만듭니다.

4) 3~4일마다 약물이 포함된 새로운 배지로 교체합니다.

5) 고정된 간격(예: 2일마다)으로 살아있는 세포 수를 계산하여 형질감염되지 않은 세포의 성장을 억제하는 적절한 농도를 결정합니다. 안정적인 형질감염체 선택을 위한 작업 농도로 이상적인 일수(일반적으로 7-10일) 내에 대부분의 세포를 죽일 수 있는 가장 낮은 농도를 선택합니다.

4. 포유류 안정형 형질전환 세포주 스크리닝

1) 형질감염 48시간 후, 세포를 적절한 농도(직접 또는 희석)의 하이그로마이신 B가 함유된 스크리닝 배지로 계대 배양했습니다.

참고: 항생제는 활발하게 분열하는 세포에 가장 효과적입니다. 세포가 너무 조밀하면 항생제가 세포를 죽이지 못합니다. 세포가 25% 이상 합쳐지지 않도록 세포를 분할합니다.

2) 3~4일마다 선별매체를 교체하세요.

3) 스크리닝 7일 후 세포 콜로니 형성을 측정합니다. 콜로니 형성은 숙주 세포 유형, 형질감염 및 스크리닝 효과에 따라 1주일 이상 걸릴 수 있습니다.

4) 5~10개의 내성 클론을 골라 35mm 세포 배양 플레이트로 옮긴 후, 약물이 함유된 스크리닝 배지에서 7일간 배양합니다.

5) 배양을 위한 약물이 첨가되지 않은 새로운 배지로 교체합니다.

서류:

안전 데이터 시트

60225 _MSDS_HB22042 0 _EN.pdf

매뉴얼

60225 _설명서_HB2 5 011 5 _EN.pdf