Aureobasidin A는 AbA, Basifungin, breomycin A라고도 하며, 필라멘트 곰팡이 Aureobasidium Pullulans No. R106에서 분리된 순환 에스테르 펩타이드 항생제입니다. 강력한 항진균 능력을 가지고 있으며 이노시톨 인산화 세라마이드 합성효소 AUR1의 억제제입니다. 낮은 농도(0.1-0.5μg/mL)에서도 효모에 독성이 있습니다. Aureobasidin A에 민감한 균류 종에는 Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharces pombe, Candida glabrata, Aspergillus nidulans 및 A. niger가 있습니다. Aureobasidin A에 민감한 균류 종에는 치과 효모(Saccharomyces cerevisiae), Schizaccharomyces millet(Schizosaccharomyces pombe), Candida glabrata(Candida glabrata), Aspergillus nest(Aspergillus nidulans) 및 Aspergillus niger(A. niger.)가 있습니다. 작용 기전은 Aureobasidin A가 균류 성장에 의존하는 이노시톨 포스포라미다이트(inositol phosphorylceramide, IPC) 합성효소의 활성을 억제하고 스핑고지질 합성을 방해하여 균주를 더욱 죽인다는 것입니다. IPC 합성효소를 인코딩하는 더 많은 유전자는 Saccharomyces cerevisiae의 AUR 1 유전자와 상동성을 가진 A. sinensis의 AURA 유전자로 연구되었습니다. 이러한 코딩 유전자를 돌연변이시키면 AUR 1-C 유전자와 같이 균주가 Aureobasidin A에 내성을 갖게 됩니다.

오레오바시딘 A는 양성 클론을 스크리닝하기 위한 약물 선택 마커로 매우 적합합니다. 오레오바시딘 A 내성은 또한 효모 단일 하이브리드 및 2중 하이브리드 연구에서 이상적인 리포터입니다. 이 제품은 1 mg/mL 농도의 메탄올에 용해된 오레오바시딘 A 용액입니다.

특징

순도 ≥ 97%

공장 대량 생산 방식을 이용한 표준화된 생산

응용 프로그램

효모 2종 하이브리드 연구

효모 단일 하이브리드 연구

엄격한 효모 약물 선택 마커

Aureobasidin A 저항성은 효모 교잡 연구를 위한 이상적인 리포터입니다.

명세서

구성 요소

배송 및 보관

아우 레오바시딘 A ( AbA ) 제품은 -15 ℃ ~ -25 ℃ 에서 2 년간 보관 가능합니다 .

지침

1. 작업 집중력

구체적인 농도에 대해서는 관련 문헌을 참고하시고, 본인의 실험 조건(실험 목적, 세포 유형, 배양 특성 등)에 맞춰 탐색하고 최적화하시기 바랍니다.

2. 세포실험(시험관내실험)

아우레오바시딘 A는 세라마이드 중독과 필수 이노시톨포스포릴세라마이드 결핍을 통해 효모 세포의 성장을 억제합니다 ^[1] .

각 CArG-박스 모티프의 트리플 탠덤 반복이 합성되었습니다. 모든 DNA 단편은 적절한 제한 부위를 사용하여 Y1H 벡터 pAbAi(Clontech, Mountain View, USA)에 클로닝되었습니다. 그런 다음, 조립된 각 pAbAi 구조를 BstbI로 선형화하고 Yeast Transformation System 2 Manual(Clontech, Mountain View, USA)에 따라 Saccharomyces cerevisiae Y1HGold 균주로 형질전환했습니다. 원하는 DNA 단편을 운반하는 클론은 표시된 대로 100 ~ 900ng/mL 농도의 Aureobasidin A가 보충된 합성 우라실 드롭아웃 배지에서 자동 활성화에 대해 스크리닝되었습니다(Clontech, Mountain View, USA) ^[2] .

SlBES1 유전자의 오픈 리딩 프레임(ORF)은 증폭되어 pGBKT7-GAL4BD 플라스미드에 연결되었습니다. 융합 GAL4BD-SlBES1 구성체는 Y2H Gold 효모 세포로 추가로 형질 전환되었습니다. SD/ − Trp 배지 플레이트는 효모 형질 전환체를 배양하는 데 사용되었습니다. 형질 전환체의 α -galactosidase 활성은 X- α -gal로 확인되었고 AUR1-C의 발현은 Aureobasidin A ^[3] 로 스크리닝되었습니다 .

3. 다양한 효모에 대한 Aureobasidin의 최소 억제 농도

4. 작동 절차(AbA에 저항하는 효모 형질 전환 시스템용)

1) 50ml의 YPD 배지에 0.5ml의 하룻밤 효모 배양액을 첨가합니다(성분: 1L 액체 배지에는 효모 추출물 10g, 폴리펩톤 20g, D-포도당 20g이 포함됩니다. 고체 배지의 경우 추가로 2% 아가를 첨가합니다).

2) 30 ℃ 에서 약 6시간 동안 배양하여 OD660이 1-2가 될 때까지 배양한다. 이배체를 사용할 경우 OD660을 2-4로 측정한다.

3) 1,000 × g에서 5분간 원심분리합니다.

4) 펠릿을 10 mL의 Solution A(성분: 100 mM 아세트산 리튬, 10 mM 트리스-HCl pH 7.5, 1 mM EDTA)에 현탁시킨 후 1,000 × g에서 5분간 원심분리합니다.

5) E는 OD660이 150이 될 때까지 펠릿을 용액 A에 현탁합니다.

6) 세포 현탁액 100 µL를 튜브에 나누어 넣고 30 ℃ 에서 1시간 동안 배양합니다.

7) 벡터(원형 또는 선형 DNA) 5 µg과 캐리어 DNA(100 ℃ 에서 10분간 가열한 후 급냉) 150 µg을 첨가합니다.

참고: pAUR101은 형질전환을 위해 선형 DNA가 필요합니다. 원형 DNA를 사용하면 형질전환 효율이 떨어지거나 실패할 수도 있습니다. pAUR112와 pAUR123은 형질전환을 위해 완전한 플라스미드 DNA가 필요합니다.

8) 850 µL의 용액 B를 첨가합니다(성분: 폴리에틸렌 글리콜 4000 40g을 용액 A 100 mL에 녹인 후 잘 섞습니다. 사용 전에 새 용액을 준비합니다). 그리고 부드럽게 섞습니다.

9) 30 ℃ 에서 30분간 배양한 후, 42 ℃ 에서 15분간 배양합니다.

10) 실온에 10분간 두세요.

11) 1분 동안 5,000 rpm으로 원심분리한 후, 펠릿을 5 mL의 YPD 배지에 재부유시킵니다.

12) 30 ℃ 에서 6시간에서 밤새도록 배양합니다.

13) 5,000~10,000 rpm에서 원심분리한 후, 펠릿을 0.9% NaCl 1~10 mL에 현탁시킵니다.

14) 세포 현탁액 100 µL를 YPD 선택 배지 플레이트(균주 유형에 따라 특정 농도의 AbA 포함)에 놓습니다. 형질 전환이 완료될 때까지 30 ℃ 에서 3~4일 동안 배양합니다.

15) 양성 형질전환체를 선택하고, 형질전환 효율(플라스미드 DNA 1마이크로그램당 형질전환된 집락 수로 표현)을 결정합니다.

서류:

안전 데이터 시트

60231 _MSDS_HB22042 0 _EN.pdf

매뉴얼

60231 _설명서_HB2 5 011 6 _EN.pdf

그림

그림 1 . 효모 플레이트 성장 차트

실험균주 : GS115

사용량 : 0.05 μg/mL 、 0.1 μg/mL 、 0.5 μg/mL 、 1 μg/mL

치료 : 3-5 낮 에는 3 0 ℃

위쪽 줄은 예센 제품이고, 아래쪽 줄은 T* 브랜드입니다.