Isothermische amplificatietechnologie kan het doel bereiken van het amplificeren van specifieke nucleïnezuursequenties onder constante temperatuuromstandigheden. Vanwege de kenmerken van geen speciale apparatuur, korte amplificatietijd en hoge gevoeligheid, heeft het goede toepassingsvooruitzichten getoond in on-site detectie en point-of-care diagnose en is het zeer geschikt voor de ontwikkeling van moleculaire diagnostische hulpmiddelen.

In de context van de nieuwe coronaviruspandemie met toenemende spanningen en besmettelijkheid kan isothermische amplificatietechnologie het nieuwe coronavirus detecteren snel met eenvoudige instrumenten, wat bijdraagt ​​aan de oplossing van het probleem dat sommige COVID-19-patiënten niet snel kunnen worden bevestigd vanwege de lange detectietijd en de hoge eisen aan detectieapparatuur en reagentia van traditionele PCR-technieken. Dus wat is het principe van RT-LAMP, een van de isotherme versterkingstechnieken? Wat zijn de hoogwaardige grondstoffen die Yeasen kan voorzien?

1. Wat is het principe van RT-LAMP?
2. Primerontwerp voor RT-LAMP
3. Welke grondstoffen kunnen Yeasen voorzien?
4. Productselectiegids

1. Wat is het principe van RT-LAMP?

In 2000 hebben de Japanse geleerden Notomi en anderen een nieuwe nucleïnezuuramplificatietechnologie ontwikkeld, genaamd loop-mediated isothermal amplification (LAMP). LAMP gebruikt 4 specifieke primers die zijn ontworpen voor 6 regio's van het doelgen en gebruikt strengverplaatsings-DNA-polymerase om 109 kopieën van de doelsequentie te amplificeren in tientallen minuten onder isotherme omstandigheden (60～65 ℃). De resultaten werden beoordeeld door agarosegelelektroforese en de positieve resultaten toonden laddervormige banden. LAMP heeft de kenmerken van sterke specificiteit, hoge gevoeligheid, snelle en eenvoudige bediening en lage kosten. Met de voortdurende verbetering en perfectie van deze technologie wordt deze momenteel gebruikt bij de detectie van verschillende pathogene micro-organismen.

RT-LAMP is een methode waarbij reverse transcriptase wordt toegevoegd aan het LAMP-amplificatiesysteem, wat de directe detectie van viraal RNA kan realiseren. De amplificatie-efficiëntie van LAMP is extreem hoog, dus een grote hoeveelheid nucleïnezuur kan worden geamplificeerd met slechts een kleine hoeveelheid cDNA. De tijd van reverse transcriptie in het nucleïnezuuramplificatieproces wordt bespaard en de detectiesnelheid van RNA wordt versneld.

DNA bevindt zich in een toestand van dynamisch evenwicht bij ongeveer 65℃. Onder invloed van strengverplaatsings-DNA-polymerase, beginnend bij het 3'-uiteinde van het F2-segment van de FIP-primer, wordt het gepaard met de complementaire sequentie van het template-DNA om de strengverplaatsings-DNA-synthese te initiëren. De F3-primer is complementair aan F3c aan het voorste uiteinde van F2c en neemt het 3'-uiteinde als startpunt om zijn DNA te synthetiseren, terwijl de DNA-streng die is gesynthetiseerd door de leidende FIP-primer wordt vervangen door de werking van een strengverplaatsings-DNA-polymerase. Breid naar voren uit. De DNA-streng die is gesynthetiseerd door de laatste F3-primer vormt een dubbele streng met één template-DNA-streng. De DNA-streng die is gesynthetiseerd door de FIP-primer wordt vervangen door de F3-primerstreng om een ​​enkele streng te genereren. Deze enkele streng heeft complementaire F1c- en F1-segmenten aan het 5'-uiteinde, dus zelf-baseparing wordt uitgevoerd om een ​​cirkelvormige structuur te vormen. En de BIP-primer wordt gehybridiseerd en gecombineerd met de enkelstrengs streng, en het 3'-uiteinde van de BIP-primer wordt gebruikt als startpunt om een ​​complementaire streng te synthetiseren, en de structuur wordt in het proces geopend.Vervolgens worden primers die lijken op F3 en B3 ingevoegd vanuit de BIP-primer, wordt base-complementaire paring uitgevoerd en wordt een nieuwe complementaire streng gesynthetiseerd vanuit het 3'-uiteinde als startpunt. Er zijn complementaire sequenties aan beide uiteinden van het vervangen enkelstrengs DNA en zelf-base-paring vindt plaats om een ​​cirkelvormige structuur te vormen, zodat de hele keten een halterachtige structuur vertoont. Deze structuur is de startstructuur van de amplificatiecyclus van de RT-LAMP-methode.

In de haltervormige structuur wordt de DNA-extensie uitgevoerd met behulp van het F1-segment aan het 3'-uiteinde als startpunt en zichzelf als sjabloon. En de FIP-primer F2 hybridiseert met de enkelstrengs F2c op de lus om een ​​nieuwe ronde van strengverplaatsingsreactie te starten. Het dubbelstrengs nucleïnezuur dat is gesynthetiseerd uit het F1-segment wordt gedissocieerd en op dezelfde manier wordt een circulaire structuur gevormd op het nucleïnezuur. Er is een enkelstrengs vorm van B2c op de circulaire structuur en B2 op de BIP-primer hybridiseert ermee om een ​​nieuwe ronde van amplificatie te starten en een circulaire structuur wordt gevormd via hetzelfde proces. Volgens dit proces doorlopen complementaire sequenties op dezelfde streng een cyclus van paring, strengextensie en vormen uiteindelijk structuren van verschillende groottes.

2. Primerontwerp voor RT-LAMP

Primerontwerp is de sleutel tot succesvolle amplificatie en detectie van RT-LAMP. RT-LAMP-primers omvatten twee buitenste primers (F3 en B3) en twee binnenste primers (FIP en BIP). F3-primer: de stroomopwaartse buitenste primer, bestaande uit de F3-regio, is complementair aan de F3c-regio van het doelgen. FIP-primer: stroomopwaartse interne primer, bestaande uit de F2-regio, de F2c-regio aan het 3'-uiteinde van het doelgen in de F2-regio is complementair aan de F1c-regio aan het 5'-uiteinde van het doelgen. BIP-primer: stroomafwaartse interne primer, samengesteld uit de B2-regio, de B2-regio is complementair aan de B2c-regio aan het 3'-uiteinde van het doelgen en heeft dezelfde sequentie als de B1c-regio aan het 5'-uiteinde van het doelgen.

Vergelijkbaar met PCR, moeten primer design principes aandacht besteden aan factoren zoals base samenstelling, GC inhoud en substructuur. Daarnaast moeten de volgende punten worden opgemerkt. De 5' eindgedeelten van de binnenste primers FIP en BIP, d.w.z. F1c en B1c, zijn over het algemeen 8-50 bp lang. De lengte is bij voorkeur 15 tot 25 bp, en de Tm waarde is groter dan de Tm waarden van F2 en B2 bij het 3' eindgedeelte. De 3' eindgedeelten van de binnenste primers FIP en BIP, d.w.z. F2 en B2, zijn over het algemeen 8-50 bp lang. De lengte is bij voorkeur 15-25 bp, en de Tm waarde is consistent met de optimale temperatuur van de Bst DNA polymerase geselecteerd in het experiment. De lengtes van de buitenste primers F3 en B3 zijn over het algemeen 8-50 bp. De lengte is bij voorkeur 15-25 bp, en de Tm waarde is kleiner dan die van F2 en B2. Bij het ontwerpen van primers moet rekening worden gehouden met de lusstructuur en de grootte van de doelsequentie. Wanneer het aantal basen in de lus groter is dan 40 bp en de grootte van de doelsequentie 130-200 bp is, is de amplificatie-efficiëntie het hoogst.

3. Welke grondstoffen kunnen Yeasen voorzien?

3.1 [Nieuwe upgrade] Yeasen Beste Plus DNA-polymerase

De onlangs geüpgradede Hieff™ Bst Plus DNA-polymerase (Cat.nr. 14402ES, 14403ES) wordt verkregen door het tot expressie brengen en zuiveren van het DNA-polymerasegen van Bacillus stearothermophilus sp waarbij het 5′→3′-exonucleasedomein in E. coli ontbreekt.Het enzym heeft een sterk vermogen om strengen te verplaatsen en heeft als voordelen een hoge gevoeligheid, een hoge amplificatie-efficiëntie en een hoge dUTP-tolerantie. Het kan op grote schaal worden gebruikt bij de realtime detectie van pathogenen op basis van isotherme amplificatietechnologie.

3.1.1 Snel en hoge gevoeligheid

Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase heeft een hoge gevoeligheid en kan het doelgen detecteren vanaf slechts 5 kopieën. De hoeveelheid template is op femtogram (fg) niveau en de amplificatiesnelheid is sneller dan bij concurrerende producten.

Figuur 1. De RT-LAMP-reactie werd uitgevoerd met Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase (Oranje) en Bst-enzymen van concurrent N (Grijs) en concurrent T (Blauw) om SARS-CoV-2 te versterken. De resultaten tonen aan dat Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase kan de drempelwaarde altijd sneller bereiken dan concurrerende producten en de amplificatiesnelheid is hoger.

4. Productselectiegids

De producten die door Yeasen zijn als volgt:

Tabel 1.Productinformatie