Het dubbele blok anti-TAQ DNA-polymerase-antilichaam om niet-specifieke amplificatie te verminderen

Moleculaire diagnose is het snelst ontwikkelende subveld op het gebied van IVD. Het heeft de voordelen van een korte detectietijd, hoge gevoeligheid en sterke specificiteit. Het wordt veel gebruikt bij gelijktijdige diagnose van tumoren en screening van infectieziekten en genetische ziekten. Op het gebied van moleculaire diagnose is PCR niet alleen het meest volwassen technologieplatform met het grootste marktaandeel, maar ook de "gouden standaard"-technologie van klinische diagnose. Bij de traditionele PCR-reactie treedt vaak het probleem van niet-specifieke amplificatie op. Niet-specifieke amplificatie heeft direct invloed op de interpretatie van detectieresultaten en zal leiden tot een afname van de amplificatiegevoeligheid en zelfs de opbrengst van doelfragmenten. Hoe vindt niet-specifieke amplificatie plaats en hoe kan dit effectief worden vermeden?

1. Conventionele DNA-polymerase kan leiden tot niet-specifieke amplificatie

2. Hot Start Polymerase kan de amplificatiespecificiteit verbeteren

3. Dubbelblok Taq-antilichaam kan de amplificatiespecificiteit en stabiliteit verdubbelen

4. Prestatieweergave van Yeasen's Dubbelblok Taq antilichaam

5. Productinformatie

1. Conventionele DNA-polymerase kan leiden tot niet-specifieke amplificatie

De slechte sequentiespecificiteit van primers is de directe oorzaak van niet-specifieke amplificatie. Als promotor van conventionele DNA-polymerase kan zijn exonuclease-activiteit de DNA-primersequentie afkappen tijdens de voorbereiding van het PCR-systeem, om de specificiteit van primers te verminderen.

Bovendien heeft conventionele DNA-polymerase niet alleen exonuclease-activiteit, maar ook polymerase-activiteit. Hoewel de optimale extensietemperatuur van DNA-polymerase 72℃ is, is de polymerase nog steeds actief bij kamertemperatuur. Daarom kunnen primers tijdens de voorbereiding van de PCR-reactie en het eerste verwarmingsproces niet-specifieke bindingen vormen met enkele strengen-templates en zich uitstrekken onder de werking van Taq DNA-polymerase, wat resulteert in de amplificatie van niet-doelsequenties en de specificiteit van de reactie beïnvloedt.

Daarom worden PCR-systemen vaak op ijs geconfigureerd om de activiteit van DNA-polymerase te remmen. Hoewel deze methode eenvoudig en goedkoop is, kan het de enzymactiviteit niet volledig remmen, dus kan het de amplificatie van niet-specifieke producten niet elimineren.

2. Hot Start Polymerase kan de amplificatiespecificiteit verbeteren

Hot start polymerase is de kerncomponent van hot start PCR. Bij kamertemperatuur wordt de actieve site van DNA polymerase geblokkeerd door een enzymmodifier. Pas na PCR denaturatie bij 95℃ valt de enzymmodifier af en wordt de enzymactiviteit gestart, waardoor niet-specifieke amplificatie door het enzym wordt vermeden.

Momenteel omvatten de meest gebruikte hot start modificatiemethoden van DNA polymerase op de markt voornamelijk een chemische methode, ligand methode en antilichaam methode. Onder hen is het blokkerende effect van antilichaam-gemodificeerde hot start polymerase het beste, en de vrijgavesnelheid van enzymactiviteit is snel, wat de reactietijd van PCR aanzienlijk kan verkorten. Het is een hot start enzym modificatiemethode die veel wordt gebruikt op de IVD markt.

Er dient echter opgemerkt te worden dat de traditionele antilichaam hot start-methode alleen de 5'→3' polymerase-activiteit van Taq DNA-polymerase blokkeert, waardoor alleen niet-specifieke amplificatie kan worden voorkomen die wordt veroorzaakt door mismatch of primerdimeer bij lage temperaturen.Echter, zoals hierboven vermeld, heeft Taq DNA polymerase niet alleen 5'→3' polymerase activiteit maar ook 5'→3' exonuclease activiteit. Deze exonuclease activiteit kan leiden tot de degradatie van niet-passende probes of andere materialen bij lage temperaturen, wat resulteert in sommige niet-specifieke signalen.

3. Dubbelblok Taq-antilichaam kan de amplificatiespecificiteit en stabiliteit verdubbelen

Als innovatieve leider in de binnenlandse moleculaire enzymenindustrie, Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (hierna genoemd Yeasen) richt zich op R&D en productie van moleculaire enzymgrondstoffen en durft te innoveren. Vertrouwend op zijn eigen volwassen antilichaamscreeningplatform, screent het het blokkerende antilichaam met Taq DNA-polymerase als doelmolecuul. Na jaren van nauwgezet onderzoek en systeemoptimalisatie heeft het het dubbelblok anti-Taq DNA-polymerase-antilichaam, Het kan niet alleen de polymerase-activiteit van Taq DNA-polymerase blokkeren, maar ook de exonuclease-activiteit van Taq DNA-polymerase. In een tweeledige aanpak kan het niet alleen effectief niet-specifieke amplificatie voorkomen die wordt veroorzaakt door mismatch of primerdimeer, maar ook voorkomen dat materiaaldegradatie niet-specifieke signalen genereert, en de stabiliteit van het reagens dubbel verbeteren.

4. Prestatieweergave van Yeasen's Dubbelblok Taq antilichaam

4.1 Het gebruik van Double-Block Taq-antilichaam is nauwkeuriger en gevoeliger

Na het blokkeren van Taq-polymerase met Yeasendubbelblok antilichaam en het antilichaam van T-bedrijf, werden de positieve monsters gedetecteerd door ARMS-PCR.

Figuur 1. ARMS-PCR-amplificatiecurve; Blauw: blokkerende antistof van T-bedrijf; Rood: Yeasendubbelblok antilichaam

Uit figuur 1 blijkt dat de Taq-polymerase geblokkeerd door YeasenHet dubbelblok-antilichaam van heeft een nauwkeurige typering en een hogere gevoeligheid bij ARMS-PCR-amplificatie.

4.2 Het Double-Block Taq-antilichaam effectief De exonuclease-activiteit van Taq DNA-polymerase geblokkeerd

De gesynthetiseerde primerprobes werden gekoppeld aan de reactieoplossing van Taq DNA-polymerase, respectievelijk geblokkeerd door ongesloten en dubbelgeblokkeerde antilichamen, en reageerden bij 40℃ om hun fluorescentiesignalen te detecteren.

Figuur 2. Detectie van de blokkerende efficiëntie van dubbelblok-antilichaam voor exonuclease-activiteit; Geel: niet-gesloten Taq DNA-polymerasegroep; Paars: Taq DNA-polymerasegroep geblokkeerd door dubbelblok-antilichaam

Dit is te zien in figuur 2 dat het dubbelblok-antilichaam de exonuclease-activiteit van Taq DNA-polymerase effectief kan blokkeren.

4.3 Dubbelblok Taq-antilichaam kan de stabiliteit van detectiereagens effectief verbeteren

Taq DNA-polymerase werd geblokkeerd met respectievelijk traditioneel blokkerend antilichaam en dubbelblokkerend antilichaam en geconfigureerd in een volledige premix met primersonde. 10000 kopieën van ASF-plasmide werden versterkt bij 4℃ gedurende 10 dagen of bij 37℃ gedurende 1, 3 en 5 dagen. De amplificatiecurve en Ct-waardeveranderingen werden waargenomen en de effecten van traditioneel blokkerend antilichaam en dubbelblokkerend antilichaam op de stabiliteit van de volledige premixreactieoplossing werden vergeleken.

Figuur 3.Amplificatiecurve van 10.000 kopieën van ASF-plasmide versterkt door traditionele blokkerende antilichaam (a) en dubbelblokkerende antilichaam (b) blokkerende reactieoplossing; Blauw: 10 dagen bewaren bij 4℃; Rood: geplaatst op 4℃ gedurende 0 dagen (controle)

Uit Figuur 3 blijkt dat het dubbelblok-antilichaam de stabiliteit van de reactieoplossing kan handhaven en de stabiliteit van het detectiereagens effectief kan verbeteren dan het traditionele blokkerende antilichaam. De amplificatiecurve en Ct-waarde veranderden niet significant nadat de hele premix met primerprobe werd geblokkeerd door een dubbelblok-antilichaam en gedurende 10 dagen op 4℃ werd geplaatst.

Figuur 4. Amplificatiecurve van 10.000 kopieën van ASF-plasmide versterkt door traditionele blokkerende antilichaam (a) en dubbelblokkerende antilichaam (b) blokkerende reactieoplossing; Blauw: 5 dagen bewaren bij 37℃; Groen: 37℃ gedurende 3 dagen; Geel: 37℃ gedurende 1 dag; Rood: geplaatst op 37℃ gedurende 0 dagen (controle)

Uit Figuur 4 blijkt dat het dubbelblok-antilichaam de stabiliteit van de reactieoplossing kan handhaven en de stabiliteit van het detectiereagens effectief kan verbeteren dan het traditionele blokkerende antilichaam. Dubbelblok-antilichaam blokkeert de hele premix die de primer-probe bevat, en het verschil in Ct-waarde is minder dan 0,2 na plaatsing op 37℃ gedurende 1, 3 en 5 dagen.

4.4 Double-Block Taq-antilichaam helpt het probleem van basislijnafwijking op te lossen

Wanneer bepaalde primers samenwerken met een specifieke buffer en instrumenten, zal er sprake zijn van basislijndrift. Yeasen probeerden veel methoden om het basislijnprobleem te verbeteren en ontdekten dat dubbelblok-antilichaam beter leidde tot een stabiele basislijn.

Figuur 5. Amplificatiecurve van het N-gen (a) en het ACT-gen (b); Rood: traditioneel blokkerend antilichaam; Groen: dubbelblok antilichaam

Zoals blijkt uit Figuur 5 kan het gebruik van dubbelblok-antilichamen onder specifieke primers en buffers helpen het probleem van basislijndrift op te lossen.

4.5 Goede lineariteit werd verkregen met behulp van dubbelblok Taq-antilichaam

100.000, 10.000, 1000 en 100 kopieën van ASF/ACT-dubbelplasmiden werden versterkt met de reactieoplossing geblokkeerd door een dubbelblok-antilichaam, en de standaardcurve werd gemaakt.

Figuur 6. Standaardcurven van het ASF-gen (a) en het ACT-gen (b) geproduceerd door een dubbelblokreactie-oplossing

Zoals blijkt uit figuur 6 is de standaardcurve R2 van het ASF-gen is 0,998 en de amplificatie-efficiëntie is 98,848%; De standaardcurve R2 van het ACT-gen was 0,998 en de amplificatie-efficiëntie was 98,113%.

4.6 Dubbelblok Taq Antilichaam kan snel enzymactiviteit vrijgeven

Taq-polymerase werd geblokkeerd met antilichamen van het geïmporteerde T-bedrijf en Yeasen's dubbelblok antilichaam (cat#31303) respectievelijk, en de enzymactiviteit werd gedetecteerd na hitteschok bij 95℃ gedurende 20 s. Het is te zien dat 31303 meer dan 95% van de enzymactiviteit kan vrijgeven na hitteschok bij 95 ℃ gedurende 20 s, wat gelijk is aan het antilichaam van T company.

Tabel 1. Enzymactiviteit

4.7 Dubbelblok Taq Antilichaam Kan veel soorten Taq-enzymen blokkeren

Drie typen Taq-enzymen (wildtype en 2 mutanten) werden geblokkeerd door Yeasen's dubbelblok antilichaam (cat#31303), en de blokkeringsverhouding was 1 μ g: 5 U, waarbij de fluorescentiewaarde en de afdichtingsefficiëntie werden gemeten. Het is te zien dat het blokkeringseffect van YeasenHet dubbelblok-antilichaam (cat#31303) is beter voor verschillende soorten Taq-enzymen.

Tabel 2. Blokkeringsefficiëntie van verschillende soorten Taq-enzymen

4.8 Yeasen'S Dubbelblok Taq-antilichaam had geen genomische resten in muizen

Door water als template te nemen voor de negatieve controle en muizengenoom als template voor de positieve controle, werden 31303 verschillende batches geamplificeerd. Er werd gevonden dat het doelfragment niet werd geamplificeerd in het monster, wat aangeeft dat er geen muizengenoomresidu in het antilichaam zat.

Figuur 7. Diagram van detectie van muizengenoomresiduen

Let op: - is de negatieve controle, + is een positieve controle en 1-5 zijn 31303 monsters van verschillende batches

5. Productinformatie