Nucleïnezuurverontreiniging is al lang een belangrijk obstakel in de vooruitgang van moleculaire diagnostische technologieën. Naarmate er gevoeligere diagnostische methoden worden ontwikkeld, is de vraag naar hogere zuiverheid van enzymen en eiwitten toegenomen. Een van de belangrijkste uitdagingen bij de productie van eiwitten is het effectief verwijderen van nucleïnezuurverontreiniging. De aanwezigheid van nucleïnezuren kan de eiwitfunctie en -activiteit in gevaar brengen, wat mogelijk kan leiden tot problemen zoals niet-specifieke binding, remming van enzymactiviteit of verhoogde achtergrondsignalen, die uiteindelijk de nauwkeurigheid van diagnostische resultaten beïnvloeden.
Daarom is het ontwikkelen van efficiënte processen voor het verwijderen van nucleïnezuur tijdens de eiwitproductie zowel van cruciaal belang als essentieel.
Na jaren van technologisch onderzoek,
Uitgebreide strategieën om DNA-verontreiniging bij de productie van eiwitten te voorkomen
DNA-verontreiniging is een wijdverbreide uitdaging bij de productie van biologische producten, die een aanzienlijke impact heeft op de zuiverheid, kwaliteit en nauwkeurigheid van experimentele resultaten. De aanwezigheid van DNA in eiwitpreparaten kan leiden tot onnauwkeurige experimentele conclusies, vertekenende gegevens en mogelijk een grotere kans op vals-positieve resultaten. Voor onderzoekers en fabrikanten die betrokken zijn bij de productie van eiwitten, is het implementeren van effectieve strategieën om DNA-verontreiniging te voorkomen en te beperken essentieel. Dit artikel onderzoekt hoe DNA-verontreiniging, met name luchtverontreiniging, kan worden voorkomen en schetst methoden voor het effectief verwijderen van DNA uit eiwitmonsters.
I. Voorkomen van besmetting van DNA via de lucht
Luchtgedragen DNA-verontreiniging blijft een kritieke zorg bij de productie van eiwitten, met name in omgevingen waar microbiële en deeltjescontrole essentieel is. Om het risico op luchtgedragen DNA-verontreiniging te minimaliseren, moeten de volgende strategieën worden toegepast:
| 1. Creëer een cleanroomomgeving Het uitvoeren van eiwitproductie in een cleanroom biedt de gecontroleerde omgeving die nodig is om zwevende deeltjes en microben die DNA-verontreiniging kunnen introduceren, te minimaliseren. Cleanrooms moeten voldoen aan specifieke reinheidsnormen om een atmosfeer zonder verontreinigingen te garanderen. | 2. Implementeer HEPA-filtratiesystemen Luchtzuiveringssystemen die zijn uitgerust met HEPA-filters zijn essentieel voor het opvangen van zwevende deeltjes, waaronder stof, microbiële verontreinigingen en DNA-fragmenten. Deze filters helpen schone lucht te behouden in de hele productiefaciliteit. |
| 3. Zorg voor een positieve drukomgeving Positieve drukomgevingen voorkomen dat verontreinigde lucht van buiten de gecontroleerde ruimte binnenkomt. Door een hogere luchtdruk in het productiegebied te handhaven in vergelijking met externe omgevingen, wordt ervoor gezorgd dat eventuele lekken leiden tot het ontsnappen van lucht, niet tot het binnendringen ervan. | 4. Routinematige reinigings- en desinfectieprotocollen Regelmatige reiniging van het productiegebied met geschikte ontsmettingsmiddelen, zoals nucleasen of chloorhoudende reinigingsmiddelen, kan DNA in de lucht afbreken, waardoor het risico op besmetting afneemt. Dit is vooral belangrijk in gebieden die vaak worden aangeraakt en op oppervlakken in de buurt van apparatuur voor de productie van eiwitten. |
| 5. Beperk personeelsbewegingen Door de verplaatsing van personeel binnen cleanroomomgevingen te minimaliseren, wordt de kans op het introduceren van verontreinigingen via menselijke interactie verkleind. Aangewezen personeel moet strikte protocollen volgen met betrekking tot binnenkomst en vertrek om blootstelling te beheersen. | 6. Luchtkwaliteitsbewaking Het monitoren van de luchtkwaliteit in de cleanroom, inclusief microbiële tellingen en deeltjesniveaus, is essentieel om voortdurende naleving van productienormen te garanderen. Luchtmonsternemers en deeltjestellers kunnen worden gebruikt om de reinheid van de omgeving te beoordelen. |
| 7. Gebruik materialen voor eenmalig gebruik Door gebruik te maken van eenmalige verbruiksartikelen voor de productie van eiwitten, wordt het risico op kruisbesmetting, dat vaak voorkomt bij herbruikbare apparatuur, aanzienlijk verkleind. | 8. Gesloten productieprocessen Gesloten systemen, zoals bioreactoren of afgesloten kamers, minimaliseren blootstelling aan de open omgeving. Dit vermindert het risico op DNA-verontreiniging door de lucht, met name tijdens kritieke fasen zoals fermentatie en eiwitzuivering. |
| 9. Vermijd aerosolvorming Aerosolvorming tijdens de productie van eiwitten kan de verspreiding van DNA in de lucht vergemakkelijken. Voorzorgsmaatregelen, zoals voorzichtige behandeling en overdracht van vloeistoffen zonder agitatie, kunnen aerosolvorming minimaliseren. | 10. Gebruik van nucleasen Het behandelen van oppervlakken en apparatuur met nucleasen vóór en na gebruik kan rest-DNA afbreken dat achterblijft na processen zoals cellyse of filtratie. |
| 11. Implementeer milieu-isolatie Voor risicovolle handelingen zoals het zuiveren en formuleren van eiwitten, biedt het gebruik van isolatoren of handschoenkasten een extra beschermingslaag, waardoor het proces wordt geïsoleerd van verontreinigingen in de lucht. | 12. Speciale apparatuur en gereedschappen Door gebruik te maken van speciale apparatuur die uitsluitend wordt gebruikt voor de productie van eiwitten, wordt kruisbesmetting voorkomen via gereedschappen en instrumenten die mogelijk in andere processen zijn blootgesteld aan DNA of nucleïnezuren. |
| 13. Noodplan voor reactie op besmetting Er moet een effectief responsplan zijn om accidentele DNA-besmetting te beheren. Het protocol moet snelle identificatie-, inperkings- en herstelstappen omvatten om verspreiding te voorkomen en de impact van besmetting te minimaliseren. | 14. Opleiding van werknemers Doorlopende training van personeel over de risico's van DNA-besmetting en het belang van de juiste behandelingstechnieken zorgt ervoor dat best practices worden geïmplementeerd en protocollen voor besmettingsbestrijding worden nageleefd. |
Tweede. Het verwijderen van DNA-verontreiniging uit eiwitten
Tijdens eiwitzuivering is het verwijderen van eventuele resterende DNA-verontreiniging cruciaal voor het behoud van de eiwitkwaliteit. Er worden verschillende technieken gebruikt om DNA uit eiwitmonsters te verwijderen:
| 1. Milde cellysismethoden Niet-destructieve lysisbuffers maken het mogelijk om eiwitten vrij te geven terwijl de breuk van DNA wordt geminimaliseerd. Deze aanpak vermijdt de willekeurige vernietiging van DNA, waardoor de kans op besmetting van het eiwitmonster wordt verkleind. | 2. Geoptimaliseerde lysisomstandigheden Door factoren zoals de pH-waarde en de ionsterkte aan te passen tijdens de cellyse, kan worden voorkomen dat DNA oplost. Hierdoor wordt de hoeveelheid verontreinigend DNA in het resulterende monster verminderd. |
| 3. Nuclease-remming Het gebruik van proteaseremmers, zoals fenylmethylsulfonylfluoride (PMSF), kan de activiteit van nucleasen in cellen voorkomen, waardoor DNA-afbraak tijdens lysis beter gecontroleerd en selectiever kan plaatsvinden. | 4. Osmotische schok Osmotische shock is een zachte methode om cellen te lyseren door ze in een oplossing te plaatsen met een plotseling verschil in osmotische druk. Dit kan helpen om DNA-afgifte te verminderen, wat leidt tot schonere eiwitpreparaten. |
| 5. Enzymatische lysis Het afbreken van bacteriële celwanden met behulp van enzymen zoals lysozym is een gecontroleerde lysismethode die alleen het celmembraan aanpakt. Hierdoor wordt het risico op DNA-verontreiniging tijdens het vrijkomen van de celinhoud verkleind. | 6. Post-lysebehandeling Zodra cellen zijn afgebroken, kan onmiddellijke koeling van het monster helpen de nuclease-activiteit te verminderen. Anders zou dit leiden tot verdere DNA-afbraak in de oplossing. |
Derde. Geavanceerde methoden voor het verwijderen van nucleïnezuur
Door gebruik te maken van chromatografie of affiniteitsgebaseerde methoden in de verdere verwerking kunnen sporen van DNA-verontreinigingen uit eiwitpreparaten worden verwijderd. Anionenuitwisselings- en kationenuitwisselingschromatografie zijn twee goed ingeburgerde technieken voor het verwijderen van DNA-verontreiniging uit eiwitmonsters. Beide zijn afhankelijk van de interactie tussen nucleïnezuren en geladen oppervlakken om selectief DNA te verwijderen.
| 1. Anionenuitwisselingskolommen Anionenuitwisselingskolommen gebruiken positief geladen stationaire fasen om negatief geladen nucleïnezuren aan te trekken en te binden. Door de zoutconcentratie van de elutiebuffer aan te passen, kunnen nucleïnezuren selectief uit de eiwitbereiding worden verwijderd. | 2. Kationenuitwisselingskolommen In specifieke omstandigheden kunnen kationenuitwisselingskolommen ook worden gebruikt om nucleïnezuren te verwijderen. Door de zoutconcentratie te verhogen of de pH te wijzigen, kunnen nucleïnezuren competitief uit de kolom worden geëlueerd. |
| 3. Ultrafiltratie Bij ultrafiltratie wordt selectieve membraanfiltratie gebruikt om eiwitten van nucleïnezuren te scheiden. Zo wordt ervoor gezorgd dat DNA effectief wordt verwijderd tijdens de zuiveringsstappen. | 4. Gelfiltratiechromatografie Gelfiltratie is een size-exclusion chromatografietechniek die moleculen scheidt op basis van hun grootte. Nucleïnezuren, die groter zijn dan eiwitten, worden effectief gescheiden, waardoor er pure eiwitmonsters overblijven. |
vierde. Vermindering van DNA-verontreiniging door personeel
Personeel speelt een belangrijke rol bij de mogelijke introductie van DNA-verontreiniging in eiwitproductieprocessen. De volgende maatregelen kunnen helpen dit risico te beperken:
| 1. Uitgebreide personeelsopleiding Alle medewerkers moeten een training volgen over het belang van het beheersen van DNA-verontreiniging en over de beste werkwijzen om besmetting te voorkomen. | 2. Persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM) Personeel moet geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen dragen, zoals labjassen, handschoenen, maskers en brillen, om het risico op DNA-besmetting door menselijk contact tot een minimum te beperken. |
| 3. Handhygiëneprotocollen Regelmatig handen wassen en het gebruik van ontsmettingsmiddelen op alcoholbasis zijn essentieel om de overdracht van DNA van handen naar oppervlakken en apparatuur te beperken. | 4. Veranderingen in kleding en schoeisel Door speciale werkkleding en schoeisel te dragen, wordt voorkomen dat DNA-verontreiniging van buiten de productieruimte wordt geïntroduceerd. |
| 5. Strikte Werkgedragsregels Personeel mag niet eten, drinken of praten in het gebied waar de eiwitten worden geproduceerd, om te voorkomen dat DNA via speeksel, voedseldeeltjes of druppels in het lichaam terechtkomt. | 6. Milieumonitoring Er moet regelmatig toezicht worden gehouden op de omgeving, met inbegrip van lucht-, oppervlakte- en apparatuurcontroles, om ervoor te zorgen dat er geen DNA-verontreiniging in het productiegebied aanwezig is. |
Conclusie
Om de productie van hoogwaardige, niet-verontreinigde eiwitten te garanderen, is een allesomvattende aanpak van de bestrijding van DNA-verontreiniging noodzakelijk.Door strenge milieucontroles toe te passen, geoptimaliseerde zuiveringsmethoden te gebruiken en de nadruk te leggen op personeelstraining, kunnen de risico's die samenhangen met DNA-verontreiniging aanzienlijk worden geminimaliseerd. Deze praktijken zijn cruciaal voor het behoud van de integriteit en betrouwbaarheid van eiwitproducten in onderzoeks- en industriële toepassingen, en dragen uiteindelijk bij aan de vooruitgang van de ontwikkeling van biologische producten.
Gerelateerde producten
1. UCF.ME Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), hittelabiel
2. UCF.ME Muizen RNase-remmer
Productvoordelen
- Ultra-lage rest van UCF.ME—E. coli genomische DNA-residu <0,1 kopieën/E;
- Laag nucleaseresidu: geen resterend exonuclease, nicking-enzym of RNase;
- Sterk verteringsvermogen: 0,05 U/T kan 105 kopieën/T dU-DNA-producten verteren;
- Goede thermolabiliteit: volledige inactivering onder alle omstandigheden van 50°C gedurende 10 minuten, 55°C gedurende 5 minuten of 95°C gedurende 5 minuten;
- Compatibel met RT-qPCR-reactiesystemen: geen invloed op het detectiesysteem, zelfs niet bij hoge invoerniveaus (2U/20μL-reactiesysteem).
(1) Lage restnucleasen: geen restexonucleasen, nicking-enzymen of RNasen
Figuur 1. Resultaten van de nucleaseresidutest
(2) E. coli genomisch DNA-residu < 0,1 kopieën/E
Figuur 2. Resultaten van E.coli genomische DNA-residutest
Bestelgegevens
| Kat: | Naam | Sollicitatie |
| 14321 | Hieff UNICON UCF. ME™ Geavanceerde Hotstart Taq DNA Polymerase | PCR |
| 14608 | Hifair UCF.ME™ V Reverse Transcriptase (200 U/μL) | RT-PCR |
| UCF.ME™ Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), hittelabiel, 1 U/μL | RT-PCR | |
| UCF-certificaat.ME™ Muizen RNase-remmer (40 U/µL) | RT-PCR | |
| Hifair™ V2 Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG Plus, GC Enhancer Plus) | RT-PCR | |
| Hieff NGS™ ds-cDNA-synthesekit | mNGS | |
| 13501 | Hieff NGS™ ds-cDNA Synthese Kit (gDNA digester plus) | mNGS |
| Hieff NGS™ OnePot Flash DNA Bibliotheekvoorbereidingskit | mNGS | |
| 13490 | Hieff NGS™ OnePot ll DNA-bibliotheekvoorbereidingskit voor Illumina | mNGS |
| 12946 | 10x Hieff NGS™ 1e cDNA-synthesekit | tNGS voor pathogeen |
| 4x Hieff™ Multiplex RT-PCR-kit | tNGS voor pathogeen | |
| 4x Hieff™ Multiplex PCR Mastermix | NGS voor pathogeen | |
| 12977 | 4x Hieff™ Multiplex PCR Master Mix 2.0 | NGS voor pathogeen |