Verschillende soorten magnetische kralen in NGS: DNA\RNA\mRNA magnetische kralen
Magnetische kralen zijn een van de noodzakelijke producten bij de constructie van high-throughput sequencing bibliotheken. Ze kunnen DNA of RNA zuiveren, DNA-fragmenten van doelgrootte screenen en doelnucleïnezuren verrijken. Met de ontwikkeling van sequencing technologie zijn magnetische kralen ontstaan die gespecialiseerd zijn in verschillende toepassingsgebieden, waaronder DNA-zuiveringsmagnetische kralen, DNA-grootteselectiemagnetische kralen, RNA-zuiveringsmagnetische kralen en mRNA-verrijkingsmagnetische kralen. Wat zijn de principes van verschillende magnetische kralen? Hoe kies je?
Vraag een gratis monster en lagere prijs aan bij bulkaankopen
1. DNA-kralen
2. Introductie van ster-DNA-kralen
3. RNA-zuiveringskorrels
4. mRNA-verrijkte magnetische kralen
5.
1. DNA Kralen
1.1 Basisprincipes
Het principe van zuivering van nucleïnezuur door magnetische kralen is gebaseerd op vaste-fase reversibele immobilisatie (SPRI). Onder bepaalde omstandigheden wordt het nucleïnezuur selectief gebonden aan de magnetische kralen, terwijl verontreinigende stoffen in de oplossing blijven. Na het aanleggen van een magnetisch veld worden de magnetische kralen die zich binden aan de doelmoleculen gescheiden van de oplossing, en vervolgens worden de magnetische kralen gereinigd om verdere verontreinigende stoffen te verwijderen. Omdat de combinatie van magnetische kralen en nucleïnezuurmoleculen reversibel is, kan het nucleïnezuur worden geëlueerd van de magnetische kralen met een buffer met een laag zoutgehalte.
Het buitenste oppervlak van magnetische kralen wordt gemodificeerd met siliciumhydroxyl- of carboxylfunctionele groepen. In het zuiveringsbuffersysteem met PEG en hoge zoutionen wordt DNA gebonden met kralen door een ionenbrug van DNA-zoutioncarboxylgroep te vormen. Deze binding is omkeerbaar. De ionenbrug wordt verwijderd in de TE-buffer zonder PEG en zoutionen en uiteindelijk wordt DNA gezuiverd. Op basis van carboxylmagnetische kralen zullen verschillende magnetische kraleninputs en zuiveringsbuffers verschillende fragmentgroottes binden. De magnetische kralen binden bij voorkeur grote fragmenten van DNA, dus in de eerste ronde worden magnetische kralen gebruikt om de fragmenten te binden die groter zijn dan het doelfragment en wordt de supernatant behouden; In de tweede ronde binden de magnetische kralen het doelfragment in de supernatant en gooien de supernatant vervolgens weg; Ten slotte wordt het doelfragment geëlueerd van de magnetische kralen, waarvan de DNA-fragmenten de doelgrootte zijn.
Figuur 1. Carboxyl magnetische kralenstructuur
Figuur 2. Principe van DNA-zuiveringsmagnetische kralen
1.2 Operationeel proces
Figuur 3. DNA-zuiveringsstappen
Figuur 4. Stappen voor het selecteren van de DNA-grootte
1.3 Tips voor het gebruik van magnetische kralen
Verbeterde opbrengst en nauwkeurige maatselectie
(1) Meng goed voor gebruik en laat het in evenwicht komen Laat de magnetische kralen minimaal 30 minuten op kamertemperatuur komen.
——De oplosbaarheid van PEG in de magnetische kralen buffer wordt gemakkelijk beïnvloed door pH en temperatuur.Voor gebruik is het noodzakelijk om te equilibreren op kamertemperatuur laten komen de magnetische kralen gelijkmatig gesuspendeerd en PEG volledig opgelost om te voorkomen dat de adsorptie- en scheidingseffecten worden beïnvloed
(2) De adsorptietijd moet voldoende zijn en volledig gemengd om de adsorptie adequaat te maken;
(3) Wassen met 80% ethanol tijdens zuivering of scheiding;
——Onder 80% ethanol wordt het nucleïnezuur gedehydrateerd en verzameld, en zal niet oplossen. De resterende enzymen, buffers, onzuiverheden, etc. in het systeem worden gereinigd met ethanol om een zuiverder bibliotheek.
(4) Controleer tijdens de maatselectie het monstervolume om er zeker van te zijn dat de toevoegingsverhouding van de magnetische kralen correct is;
——Tijdens de selectie van de grootte is het noodzakelijk om het overeenkomstige volume magnetische kralen nauwkeurig in te voeren, zodat de verhouding nauwkeurig is, omdat de verandering van PEG en zout-ionconcentratie in de buffer de resultaten kan beïnvloeden.
(5) Laat de alcohol volledig verdampen vóór de elutiestap, maar voorkom dat de kralen overmatig drogen
——Over het algemeen kan het in 2~3 min. worden gedroogd. Wanneer het aantal magnetische kralen groot is en moeilijk te drogen, Het wordt aanbevolen om met meerdere centrifugebuizen te werken.
(6) Als de magnetische kralen geagglomereerd of geslabd zijn, is de elutietijd kan worden verlengd na volledig mengen;
——Het kan veroorzaakt worden door onzuiverheden in DNA of te lange droogtijd. Over het algemeen wordt aanbevolen om DNA eerst te zuiveren als er veel onzuiverheden in zitten voor maatselectie.
2. Introductie van ster-DNA-kralen
Hieff NGS™ DNA-selectieparels zijn gebaseerd op het principe van SPRI (solid phase reverse immobilization), met behulp van geïmporteerde magnetische kralengrondstoffen en een geoptimaliseerd buffersysteem, dat kan worden gebruikt voor DNA-fragmentgrootteselectie en -zuivering tijdens de constructie van de NGS-bibliotheek. Het wordt op dezelfde manier gebruikt als de gebruikte AMPure XP-parels, en de fragmentherstelefficiëntie en bibliotheekgrootteverdeling zijn zeer consistent met hen.
2.1 Inleiding tot zuiveringsprestaties
- Uniek buffersysteem: DNA-fragmenten tot 50bp kan worden hersteld.
- Hoog herstelpercentage: ≥90%.
- Verwijder effectief onzuiverheden: Verwijder effectief onzuiverheden zoals primerdimeren, dNTP, anorganisch zout en eiwitten.
- Breed toepassingsgebied: Geschikt voor DNA-zuivering in scenario's zoals enzymvertering, ligatie, klonen en het opbouwen van NGS-bibliotheken.
Tabel 1. DNA-zuivering en herstelefficiëntie van magnetische kralen met verschillende verhoudingen
| Ervaringsgroep | Herstelconcentratie van magnetische kralen in deze batch (ng/μL) | Herstelpercentage | AMPure XP-kralen Groep (ng/μl) ④ | Herstelpercentage | CV% | |||
| Verhouding | ① | ② | ③ | Gemiddeld | ||||
| 1,8× | 22.2 | 23.4 | 22.8 | 22.8 | 96,92% | 22.2 | 94,37% | 2,55% |
| 0,8× | 20.2 | 19.3 | 18.5 | 19.33 | 82,19% | 17.8 | 75,67% | 6,52% |
| 0,6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71,42% | 16.2 | 68,87% | 2,55% |
Figuur 5. Zuiveringseffect van magnetische kralen agarosegelelektroforeseresultaten
M：1kb DNA-ladder;
2.2 Prestaties van de maatselectie
- Eenvoudig naar werken: het scheidingsprincipe en de experimentele werking zijn volledig in overeenstemming met XP-magneetkralen
- Nauwkeurige grootteselectie: de grootte van gesorteerde fragmenten is nauwkeurig en stabiel
- Brede toepasbaarheid: geschikt voor gebouw DNA- en RNA-bibliotheken en aanpassing om de fragmentgrootte van verschillende monstertypen te selecteren
- Zeer hoge kostenprestatie: stabiele kwaliteit, voordeligere prijs, meer attente pre-sales en after-sales service
Figuur 6. Resultaten van DNA-grootteselectie
3. RNA-zuiveringskorrels
Hieff NGS™ RNA-reiniger is gebaseerd op het SPRI-principe, dat efficiënt eiwitten, zoutionen en andere onzuiverheden kan verwijderen om geconcentreerde RNA-monsters met een hoge zuiverheid te verkrijgen en het zure buffersysteem zorgvuldig te optimaliseren om de stabiliteit van de RNA-structuur te behouden en RNA-afbraak te voorkomen. Het is geschikt voor de constructie van RNA-bibliotheken, zuivering van totale RNA-monsters na verwijdering van rRNA, zuivering van in vitro getranscribeerde RNA-producten, zuivering van RNA-gelabelde producten, zuivering van synthetisch RNA, enz.
- Hoge kwaliteit: geïmporteerde grondstoffen, zeer stabiele kwaliteit
- Geoptimaliseerd buffersysteem: zorgt voor de zuiverheid en integriteit van RNA en voorkomt effectief RNA-degradatie
- Hoge efficiëntie: efficiënt herstel, geschikt voor RNA-bibliotheekconstructie of in vitro transcriptieproductherstel, enz.
Figuur 7. Elektroforetogram van verschillende monsters na zuivering
4. mRNA-verrijkte magnetische kralen
4.1 Principe van mRNA-isolatie
mRNA-scheiding en verrijking magnetische kralen zijn magnetische kralen die oppervlaktegemodificeerd zijn met oligo (dT). Door het principe van hybridisatie kunnen ze specifiek mRNA binden met Poly A-staart en specifiek mRNA scheiden van totaal RNA of weefselcellen. Deze kit met de geoptimaliseerde productformule kan efficiënt zeer zuiver compleet mRNA isoleren uit het RNA van cellen en weefsels van dieren, planten, insecten en eukaryotische micro-organismen.
Figuur 8.principe van verrijking en zuivering van mRNA magnetische kralen
4.2 Prestaties van mRNA-isolatiekralen
Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit is onafhankelijk ontwikkeld door
- Hoge efficiëntie: mRNA-zuivering kan binnen 45 minuten worden voltooid
- Hoge zuiverheid: oligo (dT) magnetische kralen binden specifiek mRNA
- Betrouwbaar: het verkregen mRNA is geschikt voor NGS, in vitro vertaling, RT-PCR en cDNA-synthese
Figuur 9. mRNA-isolatiekit zuivering van mRNA uit verschillende RNA-monsters
Opmerking: de opbrengst van het housekeeping-gen geeft het effect van mRNA-herstel weer. Opbrengst van rRNA-gerelateerd gen karakterisering rRNA verwijderingsefficiëntie
4.3 Veelgestelde vragen over mRNA magnetische kralen
(1) Waarom klonteren magnetische kralen samen en hoe los je dit op?
——Magnetische kralen agglomeratie zal de opbrengst en zuiverheid van mRNA verminderen. Het monster kan veel onzuiverheden bevatten, zoals polysacchariden, eiwitten en langketen-DNA. Deze onzuiverheden zullen leiden tot magnetische kralen agglomeratie. De oplossing is om de magnetische kralen door een pipet te blazen. Genomisch DNA kan worden verwijderd door middel van DNase-behandeling vóór zuivering. Als de initiële samplegrootte te groot is en de belasting van de magnetische kralen overschrijdt, zullen de magnetische kralen ook agglomereren. Het wordt aanbevolen om te werken volgens de invoerhoeveelheid in de handleiding.
(2) Waarom is de mRNA-opbrengst laag?
——Er zijn veel redenen voor een lage mRNA-opbrengst:
- Het mRNA-expressieniveau van cellen of weefsels is laag, dus we kunnen de juiste expressieperiodemonsters selecteren of de totale hoeveelheid RNA-invoer in het monster op passende wijze verhogen.
- De verhouding van magnetische kralen tot monsters is te laag, wat de combinatie van mRNA en magnetische kralen beïnvloedt. Probeer te verhogen het aantal magnetische kralen of verminder de hoeveelheid en het volume van de monsterinvoer.
- De hybridisatietijd is te kort, de incubatietijd kan worden verhoogd tot 10-15 min;
- De elutie is onvoldoende. Het is noodzakelijk om het volume van de elutiebuffer dienovereenkomstig te vergroten, de elutietijd en -temperatuur te verhogen of de elutiestap twee keer te herhalen.
(3) Hoe kun je rRNA effectief elimineren?
——Als de bewerking niet goed is, zal het rRNA niet-specifiek aan de magnetische kralen worden gebonden, samen met het mRNA tijdens de zuivering, vooral wanneer er sprake is van een grote hoeveelheid totale RNA-input. In het zuiveringsproces worden doorgaans twee bindingsrondes gebruikt om rRNA-vervuiling effectief te voorkomen. Zorg ervoor dat het geheel tijdens het wasexperiment volledig gemengd is om de niet-specifieke binding te verwijderen en probeer rRNA-vervuiling te verwijderen.
(4) Is het voor veel vervolgtoepassingen noodzakelijk om mRNA te elueren en verstoren magnetische kralen de vervolgenzymreacties?
——Sommige vervolgreacties kunnen direct met magnetische kralen worden uitgevoerd zonder mRNA's te elueren, zoals mRNA-fragmentatie en reverse transcriptie bij het opbouwen van een RNA-bibliotheek.Als PCR-reacties echter moeten worden uitgevoerd, is het noodzakelijk om ervoor te zorgen dat er geen genomische DNA-vervuiling is, anders worden er veel genomische amplificatiefragmenten gegenereerd, die de experimentele resultaten zullen verstoren. Gedetailleerde bewerkingen kunnen worden uitgevoerd volgens de instructies van overeenkomstige downstream-reacties, zoals RNA-Seq-bibliotheekconstructie
(5) Kan de kit mRNA rechtstreeks uit cellen of weefsels scheiden?
——Niet aan te raden! Het lysaat bevat enkele componenten die de binding van mRNA beïnvloeden. Het is aan te raden om een speciale kit te gebruiken.
5. Yeasen magnetische kralen product aanbeveling
Hieff NGS™ serie magnetische kralen als
Tabel 2.
| Productnaam | Kat# | Specificatie | Gebruiks- en toepassingsscenario's |
| Hoog NGS™ DNA-selectie kralen | 12601ES03 | 1 ml | 👉NGS-DNA zuivering en grootteselectie 👉PCR-productzuivering 👉Zuivering van enzymdigestie- en ligatieproducten |
| 12601ES08 | 5 ml | ||
| 12601ES56 | 60 ml | ||
| 12601ES75 | 450 ml | ||
| Hoog NGS™ RNA-reiniger | 12602ES03 | 1 ml | 👉RNA-zuivering 👉Zuivering van totale RNA-monsters na verwijdering van rRNA 👉Zuivering van RNA-gelabelde producten |
| 12602ES08 | 5 ml | ||
| 12602ES56 | 60 ml | ||
| 12602ES75 | 450 ml | ||
| Hieff NGS™ mRNA-isolatiemasterkit | 12603ES24 | 24T | 👉mRNA-isolatie en -zuivering 👉In vitro transcriptie mRNA zuivering |
| 12603ES96 | 96T |
Over Lezen
Hoeveel weet u over NGS-gerelateerde technologie?
5 minuten om het verleden en heden van DNA-selectieparels te begrijpen (inclusief resultaatanalyse en FAQ-interpretatie)