Belangrijke enzymen die betrokken zijn bij de constructie van de NGS -bibliotheek

Figuur 1. Next-generation sequencing-workflow^[2]

1. De constructie van een DNA-bibliotheek en de belangrijkste enzymen
2. Constructie van RNA-bibliotheek en zijn sleutelenzymen
3. Richtlijn voor NGS-kernenzymen bij de constructie van DNA- en RNA-bibliotheken

1. De constructie van een DNA-bibliotheek en de belangrijkste enzymen

In het proces van DNA-bibliotheekconstructie is TA-kloonligatieadapterbibliotheekconstructie momenteel de meest gebruikte technologie. Het belangrijkste bibliotheekconstructieproces is als volgt:

Figuur 2. DNA-bibliotheekconstructieproces (Illumina)

1.1 DNA-fragmentatie

De huidige sequencers hebben doorgaans een sequentielengte in het bereik van 150-500 baseparen (bp). Als gevolg hiervan is het noodzakelijk om mechanische of enzymatische fragmentatiemethoden te gebruiken om grote genomische DNA-fragmenten op te splitsen in kleinere. Mechanische fragmentatie kan leiden tot relatief veel monsterverlies en omvat een ingewikkelder operationeel proces. Aan de andere kant is enzymatische digestie een veelgebruikte methode voor het fragmenteren van genomisch DNA. In vergelijking met mechanische methoden is enzymatische digestie kosteneffectiever en eenvoudiger, waarbij de reactie slechts een bepaalde periode vereist na de toevoeging van het fragmentatie-enzym.

Momenteel zijn er voornamelijk twee typen fragmenten in gebruik. De ene is gebaseerd op de Tn5-transposase, gebaseerd op transposonprincipes, terwijl de andere een mengsel van endonucleasen gebruikt. De effectiviteit van deze fragmenten kan echter worden beïnvloed door de GC-inhoud en basevoorkeuren van het DNA. Daarentegen zijn de fragmenten die zijn ontwikkeld door Yeasen (Cat#12917) bieden een stabiel verteringseffect en vertonen een significant lagere sitepreferentie vergeleken met Tn5-transposase. Ze leveren consistent uitstekende sequentieresultaten op voor verschillende typen DNA-monsters, waaronder die van FFPE-monsters.

1.2 Eindreparatie, dA-Tailing

Het gefragmenteerde DNA genereert 5'/3' sticky ends en blunt-end DNA, en alle sticky ends moeten worden omgezet in blunt ends, inclusief 3' overhangen verwijderd en 5'-uitstekende DNA uiteinden opgevuld. Bij gebruik van TA ligatie voor adapter ligatie, moet het DNA fragment ook worden gefosforyleerd aan het 5' uiteinde en "A" worden toegevoegd aan het 3' uiteinde om complementair te zijn aan de adapter met het "T" sticky end.Het bovenstaande proces wordt voltooid door de samenwerking van T4 DNA-polymerase, T4-polynucleotidekinase en Tak DNA-polymerase.
T4 DNA-polymerase (Cat#12901) heeft 5'→3' DNA polymerase activiteit, wat de synthese van DNA langs de 5'→3' richting kan katalyseren en het 5' uitstekende uiteinde kan opvullen. Tegelijkertijd heeft het enzym ook 3'→5' exonuclease activiteit om 3' overhangende uiteinden te splitsen, waardoor DNA fragmenten met kleverige uiteinden worden getransformeerd in stomp-eind DNA.
Omdat de 5'-uiteinden van synthetische PCR-primers en adapters meestal hydroxylgroepen zijn in plaats van fosfaatgroepen, is T4-polynucleotidekinase (Cat#12902) vereist om de overdracht van ATP γ-fosfaatgroepen naar het 5'-hydroxyluiteinde van de oligonucleotideketen te katalyseren in aanwezigheid van ATP, ter voorbereiding op de volgende stap van adapterligatie.
S-Taq DNA-polymerase (Cat#13486) heeft 5'→3' polymerase-activiteit, die DNA kan synthetiseren vanuit de 5'→3' richting. Ondertussen heeft het deoxynucleotidyltransferase-activiteit, die een nucleotide "A" kan toevoegen aan het 3' uiteinde van het PCR-product.

Figuur 3. Meerdere enzymen zijn betrokken bij het uiteindelijke reparatieproces

Figuur 4. S-taq heeft een zeer hoge efficiëntie bij het toevoegen van A aan de vier basen van ATCG van het 3'-uiteinde van de gensegmenten die door capillaire elektroforese worden gedetecteerd.

1.3 Adapterligatie

Adapters vormen een cruciaal onderdeel van de bibliotheek. Binnen het domein van Illumina-sequencing omvatten de algemeen gebruikte Y-type adapters P5/P7-, Index- en Rd1/Rd2 SP-sequenties. Van deze dient de P5/P7-sequentie om te paren met de sequentie die aanwezig is op de sequentiechip, waardoor de te analyseren fragmenten worden verankerd op de flowcel om brugamplificatie uit te voeren. De Index-sequentie wordt gebruikt om onderscheid te maken tussen verschillende monsters binnen de gemengde bibliotheek die aan sequencing wordt onderworpen, terwijl Rd1/Rd2 SP de regio's aanduiden voor het binden van de Read1- en Read2-sequencingprimers.

Voor de taak van adapterligatie, T4 DNA-ligase (Cat#12996) is de standaardkeuze. Het vertoont de mogelijkheid om enkelstrengs nicks te repareren die in dubbelstrengs DNA worden aangetroffen en aangrenzende nucleotiden opnieuw te verbinden.

Figuur 5. Algemeen adapterligatieproces (Illumina)

Figuur 6. Verificatie van T4 DNA-ligasemutanten door het ligeren van 170-bp DNA met 80-bp adapters.

1.4 PCR-amplificatie

Verkrijg voldoende DNA-sequenties met adapters via PCR-reactie en voltooi de sequentiebepaling van de monsternucleïnezuursequentie op de machine. Hieff Canace^TM Pro High-Fidelity DNA Polymerase (Cat#13476) dat vaak wordt gebruikt in PCR heeft 5'→3' polymerase-activiteit en kan DNA synthetiseren in de 5'→3' richting. Daarnaast heeft het ook de activiteit van 3'→5' exonuclease, dat de verkeerde incorporatie van basen tijdens het amplificatieproces kan corrigeren, om DNA-fragmenten snel en met hoge betrouwbaarheid te amplificeren.

2. Constructie van RNA-bibliotheek en zijn sleutelenzymen

Afhankelijk van de soorten RNA kan de constructie van een RNA-bibliotheek worden onderverdeeld in een mRNA-bibliotheek, een LncRNA-bibliotheek, enz. Een conventionele RNA-bibliotheek omvat de volgende processen:

Figuur 7. Proces van mRNA-bibliotheekconstructie (Illumina)

2.1 RNA-verrijking

Of het nu om eukaryoten of prokaryoten gaat, ribosomaal RNA (rRNA) springt eruit als het meest voorkomende RNA, dat tot 80% van de totale RNA-inhoud uitmaakt. Bij het direct sequencen van het totale RNA van een monster, zal een substantieel deel van de sequentiegegevens gerelateerd zijn aan rRNA. Om deze interferentie te verminderen, moet de methode van RNA-verrijking worden gebruikt. Hiervoor zijn twee primaire methoden: mRNA-verrijking op basis van oligo-dT en rRNA-depletiemethoden.

In eukaryoten vertoont mRNA een duidelijke poly(A)-structuur aan het 3'-uiteinde. Oligo-dT-beads kunnen worden gebruikt om alle mRNA dat uit het monster is getranscribeerd, vast te leggen, waardoor het geschikt is voor transcriptionele analyse, met name bij hoogwaardige RNA-monsters. Aan de andere kant hebben rRNA-uitputtingsmethoden soepelere eisen aan de monsterkwaliteit en kunnen ze worden toegepast op zowel monsters van lage kwaliteit (bijv. FFPE-monsters) als RNA-monsters van hoge kwaliteit, evenals prokaryotische monsters. De algemeen gebruikte commerciële aanpak omvat het gebruik van RNase H-digestie om rRNA te verwijderen, waarbij deze specifieke stappen worden gevolgd:

1. Synthetiseren van specifieke oligonucleotide-probes die zijn ontworpen om te binden aan rRNA.
2. Maak gebruik van RNase H (Cat#12906), dat RNA in de RNA-DNA hybride streng kan afbreken, om selectief het rRNA dat aan de probes gebonden is te verwijderen.
3. Verwerk ten slotte de DNA-sondes met DNase I (Cat#10325), die zowel enkel- als dubbelstrengs DNA kan afbreken, en rRNA effectief kan elimineren. Voor meer informatie over DNase I kunt u deze link volgen.

Figuur 8: Schematisch diagram van enzymgebaseerde rRNA-uitputting^[5]

2.2 RNA-fragmentatie

Normaal gesproken worden grote RNA-fragmenten onder invloed van tweewaardige metaalkationen en hoge temperaturen in kleine fragmenten gebroken.

2.3 Synthese van 1e streng cDNA

Omgekeerde transcriptie van het verkregen doel-RNA in de eerste streng van cDNA. Omdat RNA gemakkelijk wordt afgebroken door RNases die in de omgeving aanwezig zijn, is het gebruik van RNase-remmer (Cat.nr. 14672) tijdens reverse transcriptie de activiteit van deze enzymen kan remmen en RNA kan beschermen tegen RNase-afbraak. Tegelijkertijd, omgekeerde transcriptase (Cat#11112) werd gebruikt om de template-RNA te reverse-transcriberen naar cDNA. De reverse transcriptase heeft RNA-afhankelijke DNA-polymeraseactiviteit en kan RNA gebruiken als template om een ​​cDNA te synthetiseren in de 5'→3'-richting. De enkelstrengs DNA is complementair aan de RNA-template.

Tijdens de 1e streng cDNA-synthese, de incorporatie van actinomycine D heeft onmiskenbaar de constructie van strengspecifieke bibliotheken verbeterd, wat de specificiteit van de keten aanzienlijk heeft verbeterd. Deze innovatie heeft het experimentele proces gestroomlijnd en vereenvoudigd voor onderzoekers.

Actinomycine D heeft echter ook nadelen: het vertoont toxiciteit en vereist bescherming tegen licht. In het huidige landschap van toenemende vraag naar premixed en plate library constructing kits, vormt de noodzaak om te beschermen tegen licht beperkingen voor de vooruitgang van plate kits.

Gelukkig, Yeasen Het ZymeEditor-platform heeft een baanbrekende MMLV-enzymmutant (Inquiry) geïntroduceerd die de functie van actinomycine D vervangt. Een nieuwe Kit (Cat: 12340ES) is ontwikkeld met geurloze, niet-giftige en no moet vermijden licht. Het biedt superieure ketenspecificiteit, waardoor zorgen met betrekking tot gezondheid en lichtgevoeligheid worden geëlimineerd.

Figuur 9: Engineering van MMLV om MMLV-mutanten te identificeren die kunnen bijdragen aan Standed RNA-seq

2.4 Synthese van 2e streng cDNA

De enkelstrengs cDNA die geproduceerd wordt door reverse transcriptie is zeer onstabiel, wat de onmiddellijke synthese van de tweede streng cDNA noodzakelijk maakt onder invloed van DNA-polymerase I. Tijdens deze tweede strengsynthese komt RNase H in het spel door de RNA-streng te verwijderen uit de RNA-DNA-hybridestructuur. Het werkt samen met DNA-polymerase I (Cat#12903) om de katalytische synthese van de complementaire tweede streng van cDNA te vergemakkelijken. DNA-polymerase I bezit 5'→3' DNA-polymerase-activiteit en synthetiseert, geleid door een template en primer, een sequentie die de enkelstrengs cDNA in de 5'→3'-richting complementeert.

De volgende stappen in het proces omvatten end repair, dA-Tailing, adapter ligation en PCR-amplificatie, die allemaal gedetailleerd worden beschreven in de DNA-bibliotheekconstructieprocedure en hier niet herhaald hoeven te worden. Het is de moeite waard om op te merken dat zodra reverse transcriptie is voltooid, er geen verdere fragmentatie van het nucleïnezuurfragment nodig is.

3. Richtlijn voor NGS-kernenzymen bij de constructie van DNA- en RNA-bibliotheken

Yeasen is een biotechnologisch bedrijf dat zich bezighoudt met onderzoek, ontwikkeling, productie en verkoop van drie belangrijke biologische reagentia: moleculen, eiwitten en cellen. Yeasen Biotechbedrijf produceert een verscheidenheid aan enzymen gerelateerd aan NGS-bibliotheekconstructie. U kunt het meest geschikte bibliotheekconstructieproduct kiezen uit de onderstaande tabel.

Tabel 1.Richtlijn voor NGS-kernenzymen bij de constructie van DNA- en RNA-bibliotheken

Tabel2.DNA & RNA Bibliotheek Voorbereidingskit

	Naam	Kat#	Notities
DNA	Hieff NGS DNA Bibliotheek Voorbereidingskit	13577ES	Tumor/Mechanische methode
	Hieff NGS OnePot Pro DNA Bibliotheek Prep Kit V2	12194ES	Tumor/ Enzymatische methode
	Hoog NGS OnePot II DNA-bibliotheekvoorbereidingskit voor Illumina	13490ES	Pathgeen/ Enzymatisch/ normale tijd (140min)
	Hieff NGS OnePot Flash DNA Bibliotheek Prep Kit	12316ES	Pathgeen/ Enzymatisch/ Ultrasnel (100 minuten)
	Hieff NGS DNA&RNA-bibliotheek Co-Prep Kit V2	12305ES	Pathgeen/ Enzymatisch/ DNA & RNA Co-Prep
RNA	Hieff NGS Ultima Dual-mode mRNA Bibliotheek Prep Kit	12308ES	Zonder oligo dT magnetische kralen, 11 buisjes
	Hieff NGS Ultima Dual-mode mRNA Bibliotheek Prep Kit	12309ES	oligo dT magnetische kralen plus, 14 buisjes
	Hieff NGS® Ultima Dual-mode RNA Bibliotheekvoorbereidingskit	12310ES	Voorgemengde versie, 5 tubes
	Hieff NGS ® EvoMax RNA Library Prep Kit (voorgemengde versie) (actinomycine D Vrij)	12340ES	Voorgemixte versie, (Actinomycine D Vrij)
	Hieff NGS® MaxUp rRNA-uitputtingskit (plant)	12254ES	Plant
	Hieff NGS® MaxUp Human rRNA Depletion Kit (rRNA & ITS/ETS)	12257ES	Menselijk

Referenties:

[1] Mardis, Elaine R. Next-Generation Sequencing Platforms[J]. Jaarlijks overzicht van analytische chemie, 2013, 6(1):287-303.
[2] Gulilat M, Lamb T, Teft WA, et al. Gerichte next generation sequencing als hulpmiddel voor recision medicine[J]. BMC Medical Genomics, 2019, 12(1):81.
[3] Lundberg KS, Dan DS, Adams M, et al. High-fidelity amplificatie met behulp van een thermostabiele DNA-polymerase geïsoleerd uit Pyrococcus furiosus[J]. Gene, 1991, 108(1):1-6.
[4] Miyazaki K. Willekeurige DNA-fragmentatie met endonuclease V: toepassing op DNA-shuffling[J]. Nucleic Acids Research, 2002, 30(24):e139.
[5] Baldwin A, Morris AR, Mukherjee N. Een eenvoudige, kosteneffectieve en schaalbare methode om menselijk ribosomaal RNA uit te putten voor RNA-seq[J]. Current Protocols, 2021, 1(6):e176.