Het Center for Drug Evaluation (CDE) van de National Medical Products Administration heeft in zijn richtlijnen voor gentherapieproducten duidelijk gesteld dat het noodzakelijk is om de hoeveelheid DNA-residu en de grootte van de residuele fragmenten te controleren, en beveelt aan om de grootte van DNA-residufragmenten zoveel mogelijk onder de 200 bp te houden. Daarom is het verwijderen van residuele nucleïnezuren in biofarmaceutica uiterst belangrijk. Met de toenemende complexiteit van productieprocessen, wordt het effectief verwijderen van residuele nucleïnezuren in omgevingen met veel zout geconfronteerd met tal van nieuwe uitdagingen:
- Tijdens het zuiveringsproces van AAV-virussen worden, om virusherstel te verbeteren, vaak buffers met hogere zoutconcentraties (200-500 mM) gebruikt. Conventionele nucleasen vertonen echter een significante afname in activiteit bij toenemende zoutconcentratie. Als het zuiveringseffect moet worden verbeterd door de hoeveelheid enzym en incubatietijd te vergroten, zal dit de kosten aanzienlijk verhogen
- Host-DNA bestaat meestal in de vorm van chromatine en wordt gemakkelijk ingekapseld door eiwitten, waardoor het DNA ontoegankelijk wordt. In omgevingen met veel zout kunnen nucleïnezuren en eiwitten effectief worden gescheiden, waardoor resterende nucleïnezuren beter worden verwijderd.
- Virusvectoren zoals AAV kunnen aggregeren door elektrostatische interacties, en deze aggregatie treedt vaker op bij lage ionsterkte en resterende DNA-omstandigheden, wat leidt tot verminderde stabiliteit en invloed heeft op de opbrengst. Een hogere zoutconcentratie kan de aggregatie van AAV-virusdeeltjes effectief verminderen, waardoor de recovery rate van AAV-virusdeeltjes wordt verbeterd
Salt Active UltraNuclease (zouttolerant breedspectrumnuclease) is een recombinant niet-specifiek endonuclease afkomstig van mariene micro-organismen. Vergeleken met UltraNuclease vertoont het optimale activiteit bij een zoutconcentratie van 500 mM en kan het efficiënt nucleïnezuurverontreiniging verwijderen, zelfs in omgevingen met veel zout.
Producttoepassingsscenario's
- Verwijdering van resterende nucleïnezuren in biologische producten: Tijdens de productie van biologische producten, zoals virussen, vaccins en eiwitten, kan UltraNuclease worden toegevoegd om resterende nucleïnezuren af te breken. Deze stap verhoogt niet alleen de opbrengst van virussen, maar vermindert ook aanzienlijk het gehalte aan resterende nucleïnezuren, waardoor de veiligheid en werkzaamheid van de geneesmiddelen wordt gewaarborgd.
- Viscositeitsreductie: Door nucleïnezuren af te breken, wordt de viscositeit van cellysaten verlaagd, wat filtratie-/ultrafiltratieprocessen tijdens de zuivering van celafgeleide deeltjes zoals virussen, AAV-vectoren en insluitlichaampjes vergemakkelijkt.
- Verbeterde resolutie en recovery: bij ELISA, tweedimensionale elektroforese en immunoblottinganalyses verbetert het de resolutie en recovery.
- Voorkomen van celaggregatie: UltraNuclease kan effectief de aggregatie van menselijke perifere mononucleaire bloedcellen (PBMC's) voorkomen.
Productprestatietesten
Het effect van een omgeving met veel zout op de enzymactiviteit (Na+)
Om het gebruik van Salt Active UltraNuclease te evenaren,
Voor dit doel,
Het experimentele proces voor het detecteren van resterend Salt Active UltraNuclease met behulp van de Salt Active UltraNuclease ELISA Kit.
Kenmerken van de UltraNuclease en Salt Active UltraNuclease ELISA-kit:
Naleving van regelgeving: Volledig gevalideerd volgens de wettelijke vereisten, validatierapporten zijn beschikbaar;
Kwaliteitsborging: Alle grondstoffen voor de kit worden onafhankelijk ontwikkeld, waardoor een controleerbare kwaliteit wordt gegarandeerd;
Hoge gevoeligheid: Kwantitatieve limiet zo laag als 23 pg/ml;
Hoge precisie: Hoge herhaalbaarheid binnen batches en lage variabiliteit tussen batches;
Sterke specificiteit: Geen kruisreactiviteit met andere gemanipuleerde celproteïnen
Prestatieparameters
| Productparameters | inhoud |
| Tijd van de test | 3,5 uur |
| Bepaling van het testprincipe | Immuno-enzymetrische test op twee locaties |
| Signaalversterking | Biotine-streptavidinesysteem |
| Detectiegolflengte | 450nm en 630nm |
| Gevoeligheid | 0,024ng/ml |
| Detectiebereik | 0.047 ng/ml~3 ng/ml |
| Detectie object | Zout Actieve UltraNuclease |
| Toepasselijk instrument | Moleculaire apparaten: M- en i-serie |
| Sollicitatie | Detectie van restnuclease in zuiveringsprocessen van cel- en gentherapie en recombinante adeno-geassocieerde virusvaccins |
Productgegevens:
Standaardcurve van de reagenskit:
Specificiteit
De kruisreactiviteit tussen het Salt Active UltraNuclease-antilichaam en de zeven eiwitten in de kit werd geëvalueerd door deze kit te gebruiken om de eiwitten te detecteren die in de zeven processen zijn toegevoegd. Er werden een positieve controle (PC-0,047 ng/mL) en een negatieve controle (NC-0 ng/mL) opgezet.
Uit de resultaten bleek dat het in de 7 processen toegevoegde eiwit dicht bij de negatieve controle lag (NC-0 ng/ml), de detectieconcentratie lager was dan de kwantificeringslimiet van deze kit (0,047 ng/ml) en er geen kruisreactie werd waargenomen. waargenomen.
SSnoek Herstelpercentage:
Voeg drie concentratiestandaarden (d.w.z. Std1 3 ng/mL, Std3 0,75 ng/mL en Std5 0,188 ng/mL) in gelijke verhoudingen toe aan de twee monsters die door de klant zijn verstrekt voor het spike recovery-experiment. De resultaten laten zien dat de spike recovery-percentages allemaal tussen 80% en 120% liggen. Spike recovery-percentage % = (gemeten waarde van het geprikte monster - gemeten waarde van het niet-geprikte monster) / theoretische waarde (hoeveelheid toegevoegde standaard) * 100%.
| Voorbeeldnaam | Testconcentratie van Salt Active UltraNuclease (ng/ml) | Hoeveelheid standaard (ng/mL) | Testresultaat (ng/ml) | Herstelpercentage piek (%) |
| TS1 | 0,04 | 3 | 1.71 | 114,00% |
| 0,75 | 0,347 | 92,53% | ||
| 0,188 | 0,085 | 90,43% | ||
| TS2 | 0,08 | 3 | 1.772 | 118,13% |
| 0,75 | 0,405 | 108,00% | ||
| 0,188 | 0,104 | 110,64% |
Nauwkeurigheid
1) Herhaalbaarheid
Drie Salt Active UltraNuclease standaardproducten met hoge, gemiddelde en lage concentratie werden geselecteerd voor herhaalde experimenten. In hetzelfde experiment werden de monsters van elke concentratie 10 keer getest, en CV%< 10%.
| Verschil binnen de batch | |||
| Theoretische concentratie (ng/ml) | Aantal herhalingen | Gemiddeld (ng/ml) | Variatiecoëfficiënt CV (%) |
| 1.5 | 10 | 1.444 | 2,97% |
| 0,188 | 10 | 0,196 | 2,27% |
| 0,047 | 10 | 0,051 | 2,56% |
2) Gemiddelde precisie
Verschillende batches kits werden gebruikt voor 3 experimenten, elk experiment werd uitgevoerd met 3 concentraties van hoog, medium en laag, en elke concentratie werd 10 keer herhaald. In totaal werden 30 gegevens verkregen van elk concentratiepunt, en de CV% van elke concentratie was minder dan 15%.
| Batchverschil | |||
| Theoretische concentratie (ng/ml) | Aantal experimenten | Gemiddeld (ng/ml) | Variatiecoëfficiënt CV (%) |
| 1.5 | 3 | 1.423 | 5,70% |
| 0,188 | 3 | 0,212 | 5,59% |
| 0,047 | 3 | 0,059 | 6,82% |
Productinformatie
| Productnaam | Product nummer | Productspecificaties |
| 20159ES25/50/60/80/90 | 25KU/50KU/100KU/1MU/5MU | |
| 36703ES96 | 96T |
Andere gerelateerde producten
| Productnaam | Productnummer | Productspecificaties |
| 20157ES25/50/60/80/90 | 25KU/50KU/100KU/1MU/5MU | |
| 36701ES59 | 96T |