Quer controlar o crescimento tumoral em camundongos nus em tempo real? Você quer saber a localização da colonização celular em camundongos? Quer saber o efeito do tratamento medicamentoso em tumores na vida? Isso pode ser alcançado instalando um rastreador na célula, permitindo que você controle a localização e o número de células a qualquer momento. Essa tecnologia é uma tecnologia de "detecção" de imagem in vivo. Então, o que é tecnologia de imagem in vivo?

1. O que é tecnologia de imagem in vivo?
2. Características da imagem da luciferase
3. Direção de aplicação da imagem de luciferase
4. Compartilhamento de exemplos experimentais
5. Perguntas frequentes
6. Informações do produto
7. Sobre a leitura

1. O que é tecnologia de imagem in vivo?

Já em 1999, o Dr. Weissleder da Universidade de Harvard nos Estados Unidos propôs o conceito de imagem molecular, ou seja, usar métodos de imagem para conduzir pesquisas qualitativas e quantitativas sobre processos biológicos in vivo nos níveis celular e molecular. A imagem in vivo é baseada em imagem molecular. Por meio desse sistema de imagem, processos biológicos como crescimento tumoral e metástase, o desenvolvimento de doenças infecciosas e a expressão de genes específicos podem ser observados em animais vivos.

In vivo, a imagem óptica de animais vivos adota principalmente duas tecnologias: bioluminescência e fluorescência. A bioluminescência é o gene da luciferase para marcar células ou DNA, enquanto a tecnologia de fluorescência usa genes repórter fluorescentes, como proteína fluorescente verde e proteína fluorescente vermelha e fluorescência, como FITC, Cy5 e Cy7. Elementos e pontos quânticos (QD) para rotulagem. A bioluminescência de mamíferos geralmente integra o gene da luciferase do vaga-lume (composto de 554 nucleotídeos, cerca de 50KD), ou seja, o gene da luciferase, no DNA cromossômico da célula de observação esperada para expressar a luciferase. Em seguida, cultive uma linhagem celular que possa expressar a luciferase de forma estável e, quando as células se dividirem, diferenciarem e transferirem, a luciferase também continuará a se expressar de forma estável. Genes, células e animais vivos podem ser marcados com o gene da luciferase. A luciferase é um tipo de enzima que pode catalisar substratos para produzir bioluminescência. Luciferases de diferentes fontes têm suas características e podem catalisar substratos para emitir diferentes cores de luz. Entre elas, a luciferase do vaga-lume tem alta sensibilidade e uma ampla faixa linear de 7 a 8 ordens de magnitude. Tornou-se o gene repórter de células de mamíferos mais comumente usado. O plasmídeo repórter da luciferase foi transferido para as células, e seu substrato luciferina foi adicionado para incubar as células. Na presença de ATP, O₂, e íons de magnésio, a luciferase poderia oxidar o substrato de luciferina para produzir uma reação de luz visível. Realize a "instalação de 'rastreador' única, e rastreie e detecte a qualquer momento". Além da luciferase do vaga-lume, a luciferase renilla às vezes é usada. Os substratos dos dois são diferentes, o substrato do primeiro é D-luciferina, e o substrato do último é coelenterazina. Os comprimentos de onda de emissão de luz dos dois são diferentes, o intervalo do comprimento de onda da luz emitido pelo primeiro é 540-600 nm, e o intervalo do comprimento de onda da luz emitido pelo último é 460-540 nm. A luz emitida pelo primeiro é mais fácil de passar pelos tecidos, enquanto o último é metabolizado mais rápido no corpo, e sua especificidade não é tão boa quanto a do primeiro. Portanto, não a maioria dos experimentos in vivo usando luciferase do vaga-lume como um gene repórter.

Figura 1.Localização de células marcadas com luciferase

O princípio óptico da bioluminescência: a luz será espalhada e absorvida ao se propagar em tecidos de mamíferos, e os fótons serão refratados ao encontrar a membrana celular e o citoplasma, e diferentes tipos de células e tecidos têm diferentes características de absorção de fótons. A hemoglobina é a principal causa da absorção de luz visível no corpo e pode absorver a maior parte da faixa azul-esverdeada da luz visível. Mas na faixa de luz vermelha da luz visível maior que 600 nm, a absorção de hemoglobina é muito pequena. Portanto, uma grande quantidade de luz pode passar pelo tecido e pela pele para ser detectada na região avermelhada. Pelo menos algumas centenas de células subcutâneas podem ser detectadas usando a tecnologia de imagem bioluminescente de animais vivos. No entanto, dependendo da profundidade da fonte de luz no camundongo, o número mínimo de células que podem ser vistas varia. De modo geral, para cada aumento de 1 cm, a intensidade luminosa atenua em 10 vezes, e a atenuação é maior para tecidos e órgãos ricos em sangue, e menor atenuação para tecidos e órgãos adjacentes aos ossos. No caso da mesma profundidade, a intensidade luminosa detectada tem uma relação linear significativa com o número de células, e a intensidade da luz detectada pode ser quantificada pelo instrumento para refletir o número de células.

Figura 2. O princípio luminescente da reação da luciferase e do sal de potássio da luciferina

Diferente da bioluminescência, a tecnologia de fluorescência usa genes repórter fluorescentes ou corantes fluorescentes (incluindo novos materiais de nano-rotulagem, como pontos quânticos fluorescentes) para rotulagem. Usando fluorescência de genes repórter, proteínas fluorescentes ou corantes, uma fonte de luz biológica in vivo pode ser criada. A bioluminescência é autofluorescência em animais sem uma fonte de luz de excitação, enquanto a fluorescência requer excitação por uma fonte de luz de excitação externa antes que possa ser detectada pelo sistema de imagem. Os marcadores fluorescentes são amplamente usados, incluindo animais, células, microrganismos, anticorpos, medicamentos, nanomateriais, etc.

2. Características da imagem da luciferase

◎ sem radiação, quase inofensivo aos organismos.

◎ bioluminescência sem fonte de luz de excitação.

◎ alta sensibilidade, centenas de células podem ser detectadas.

◎ boa penetrabilidade, profundidade de tecido de 3-4 cm ainda pode ser detectada.

◎ alta relação sinal-ruído, forte sinal de fluorescência e boa anti-interferência.

3. Direção de aplicação da imagem de luciferase

3.1 Crescimento tumoral

No experimento de tumorigênese em camundongos nus, o crescimento do tumor foi observado em tempo real, sem invasão, e não houve necessidade de remover o tumor para medição.

3.2 Medicamentos oncológicos

A influência da administração no crescimento tumoral ou na metástase foi detectada, e o substrato de fluoresceína pôde ser eliminado em 3 horas, sem interferência no experimento com o medicamento.

3.3 Localização celular

A localização e distribuição de células estranhas em animais foram detectadas.

3.4 Regulação da expressão genética

O gene alvo ou o promotor do gene alvo foi fundido com o gene da luciferase para detectar alterações na expressão genética durante o tratamento medicamentoso ou o curso da doença.

3.5 Pesquisa com células-tronco

Monitoramento do transplante, sobrevivência e proliferação de células-tronco; Rastreamento da distribuição e migração de células-tronco na vida.

4. Experiment exemplo compartilhamento

Figura 3. na vida detecção de imagem do efeito terapêutico do CAR-MUC1 T/CAR-MUC1-IL22 Células T na formação de tumores por injeção subcutânea de células HN4 em ratos^[1].

Figura 4. Após as células HUC-MSCs terem sido injetadas no músculo esquelético do camundongo, a localização das células foi detectada por na vida imagem (marcada pela seta vermelha)^[2].

Figura 5. A capacidade de na vida imagens para detectar a migração de células-tronco mesenquimais (MSC) para locais de queimadura. Células-tronco mesenquimais (MSC/FLuc) foram injetadas intravenosamente no modelo de queimadura dorsal de camundongo. Quatro dias após a injeção, sinais de bioluminescência apareceram no local lesionado da queimadura e, então, diminuíram gradualmente (a seta vermelha indica o local da queimadura)^[3].

5. Perguntas frequentes

P1: Em comparação com a tecnologia tradicional, quais são as vantagens da tecnologia de imagem de bioluminescência?

Comparada com a tecnologia tradicional, essa tecnologia é mais sensível do que os métodos tradicionais na pesquisa de metástase tumoral, terapia genética, epidemiologia, rastreamento de células-tronco, leucemia e outras pesquisas relacionadas. Ela também pode estudar de forma rápida e intuitiva a patogênese e a triagem de medicamentos de doenças relacionadas por meio de uma série de modelos de doenças animais transgênicas.

P2: Como marcar células-tronco com o gene da luciferase?

Os genes constitutivamente expressos podem ser rotulados para fazer camundongos transgênicos, e as células-tronco são rotuladas. As células-tronco hematopoiéticas são retiradas da medula óssea do camundongo e transplantadas para a medula óssea de outro camundongo. Essa tecnologia pode ser usada para rastrear a proliferação, diferenciação e migração de células-tronco hematopoiéticas no corpo. Outro método é rotular células-tronco com lentivírus.

P3: Quanto tempo é apropriado fazer o teste após a injeção de fluoresceína e quanto tempo a luminescência pode durar?

Geralmente, o sinal de fluorescência atinge o período estável mais forte após injeção intraperitoneal por 10-15min e começa a decair após 20-30min. Após 3h, a fluoresceína é eliminada e a luminescência desaparece completamente.

Q4: Como injetar fluoresceína em camundongos? Qual é a diferença entre os métodos de injeção?

A fluoresceína pode ser injetada em camundongos por injeção intraperitoneal ou injeção na veia da cauda. Ela pode se espalhar para todo o corpo dos camundongos em cerca de 1 min. Na maioria dos casos, a concentração de fluoresceína é de 150 mg/kg. Para camundongos de 20 g, cerca de 3 mg de fluoresceína podem ser usados. Para injeção intraperitoneal, a difusão é lenta, a luminescência inicial é lenta e o tempo de luminescência contínua é longo. Para a injeção na veia da cauda de fluoresceína, ela se difunde rapidamente e começa a emitir luz rapidamente, mas a duração da luminescência é curta.

6.Informações do produto

A Yeasen é uma empresa de biotecnologia engajada na pesquisa, desenvolvimento, produção e vendas de três principais reagentes biológicos: moléculas, proteínas e células. Os produtos fornecidos pela Yeasen são os seguintes.

Tabela 1. Informações do produto

7. Sobre a leitura

Uma nova geração de sistema de detecção de gene repórter de luciferase — mais fácil, mais sensível, mais preciso