Diabetes mellitus (DM), uma doença metabólica crônica sistêmica caracterizada por elevação crônica da glicemia causada por uma combinação de múltiplos fatores de doença, é uma epidemia global de saúde e está relacionada à genética familiar, fatores ambientais, e autoimunidade. Embora o DM seja conhecido há milênios e grandes avanços tenham sido alcançados em seu diagnóstico e tratamento, atualmente não há cura para a doença e suas consequências para a saúde pública estão apenas crescendo. Portanto, é particularmente importante estabelecer um modelo animal apropriado de DM e esclarecer a patogênese do DM e suas complicações. Os modelos animais de DM comumente usados são ressecção cirúrgica do pâncreas, diabetes induzido quimicamente, modelo animal de diabetes espontâneo e animais transgênicos, etc.
Atualmente, o modelo de doença diabética induzida por Estreptozotocina (STZ) é amplamente utilizado, adequado para observação de longo prazo. STZ é um composto de nitrosoureia que, uma vez dentro do corpo, pode destruir especificamente as células β pancreáticas através dos seguintes mecanismos:
(1) A injeção de altas doses de STZ pode causar diminuição da concentração de coenzima I intracelular (NAD) nas células β e, assim, inibir o metabolismo energético e proteico dependente de NAD, resultando em morte celular;
(2) STZ aumenta o óxido nítrico (NO) produção, que demonstrou participar do dano às células β;
(3) Administrado em dose baixa, o STZ pode desencadear um processo autoimune que leva à destruição das células β das ilhotas pancreáticas: células β mortas, devido a uma dose baixa de STZ, podem ser fagocitadas por macrófagos como antígenos para produzir fator estimulante Th1, tornando os linfócitos do tipo Th1 dominantes. Então, os linfócitos do tipo Th1 produzem IL-2 e IFN- γ, causando a infiltração de células inflamatórias na ilhota e a liberação de IL-1 e TNF- α, IFN- γ, NO e H2O2 para matar células, eventualmente induzindo DM.
1 SOP padrão para a construção do modelo de diabetes induzido por STZ
1.1 Preparação animal
Há dimorfismo sexual acentuado e os machos são mais suscetíveis a desenvolver diabetes. Como o estrogênio interfere na ação da STZ, as fêmeas são menos sensíveis à ação diabetogênica da STZ do que os machos. Estudos têm mostrado que as fêmeas têm uma taxa de modelagem ruim e uma taxa de mortalidade mais alta do que os machos, especialmente o tipo I.
Diabetes tipo I (DM1): Ratos (170-200 g) e ratos (17-22 g) são recomendados. Após uma semana de alimentação adaptativa, animais em jejum por 12 h seguido de injeção intraperitoneal de STZ, que pode ser facilmente operada e com alta taxa de sucesso.
Diabetes tipo II (DM2): Ratos (idade 4-5 semanas, peso 90-100 g, por exemplo SD ou Wistar) e camundongos (idade 4-5 semanas, peso 16-20 g, por exemplo C57, ICR ou Kunming) devem ser alimentados com dieta rica em gordura e açúcar por 4-6 semanas antes da administração de STZ, e o peso corporal pode ser individualmente atingido em cerca de 240-280 g e 30-35 g. SD é recomendado para ratos e C57 para camundongos.
1.2 Alimentação animal antes da administração de STZ
DM1: Permita que todos os camundongos ou ratos tenham livre acesso à dieta padrão para roedores e água durante 1 a 2 semanas de alimentação adaptativa antes do tratamento com STZ.
DM2: Consumo de uma dieta rica em gordura e açúcar para tornar a pessoa resistente à insulina antes do tratamento com STZ.
1.3 Preparação de reagentes
① Dieta rica em gordura e açúcar
A dieta rica em gordura e açúcar é feita pela mistura de ração básica para ratos com sacarose, gordura suína refinada e gema de ovo em pó em uma proporção de massa: as proporções são 10% de gordura suína, 20% de sacarose, 10% de gema de ovo em pó, 0,5% de colato de sódio e 59,5% de ração básica.
② Tampão STZ-citrato de sódio
Preparação da Solução A e Solução B: Pesar 2,1 g de ácido cítrico (PM: 210,14) e dissolvê-lo em 100 mL de água bidestilada para fazer a Solução A; pesar 2,94 g de citrato de sódio (PM: 294,10) e dissolvê-lo em 100 mL de água bidestilada para fazer a Solução B.
Preparação do Tampão Citrato de Sódio: Misture as soluções A e B em uma certa proporção (1:1,32 ou 1:1), ajuste o pH para 4,2-4,5 e esterilize por filtração usando uma membrana de filtro de 0,22 μm. Isso produz o tampão citrato de sódio necessário; é recomendado prepará-lo e usá-lo imediatamente.
Pese o pó liofilizado STZ, coloque-o em um frasco seco e estéril, embrulhe com papel alumínio e coloque-o no gelo. Adicione tampão de citrato de sódio pré-resfriado (1% p/v) para dissolver e filtre esterilizando usando uma membrana de filtro de 0,22 μm.
【Observação】① Após o pó de STZ ser retirado da geladeira, ele deve ser mantido em temperatura ambiente e longe da luz por cerca de 10 minutos até que esteja completamente descongelado. ② Após a pesagem, o frasco contendo a amostra de STZ deve ser coberto com papel alumínio para protegê-lo da luz, pois o STZ é instável. ③ Não dissolva o STZ de uma só vez se você não for habilidoso em injeção. É recomendado dissolver o STZ em grupos de acordo com a proficiência da operação. Prepare a solução de STZ para um grupo de cada vez, como 10 ou 15 ratos/camundongos por grupo.
1.4 Injeção STZ
Administre a injeção intraperitonealmente ou pela veia da cauda com base no peso em jejum do animal. Comparada à injeção intraperitoneal, a injeção na veia da cauda tem uma eficiência de utilização de fármaco maior, mas é mais desafiadora tecnicamente. Se a técnica de injeção não for proficiente, alterne entre dois grupos para a injeção, e a injeção deve ser concluída em 30 minutos.
DM1: Para camundongos, recomenda-se uma dose única alta de 100-200 mg/kg e múltiplas doses baixas de 20-50 mg/kg por cinco dias consecutivos; para ratos, a dose sugerida é de 40-70 mg/kg, administrada em uma única injeção.
DM2:Após alimentação com uma dieta rica em açúcar e gordura por 1-2 meses, para camundongos, é recomendada uma dose de 70-120 mg/kg, administrada em uma única injeção; para ratos, a dose sugerida é de 25-40 mg/kg, administrada em uma única injeção.
【Observação】É recomendado conduzir pré-experimento para determinar a dosagem apropriada de STZ, devido ao peso diferente, tolerância ao medicamento, tempo de jejum, método de injeção e processo de alimentação dos animais experimentais. Não realize o experimento cegamente diretamente de acordo com a dosagem na literatura.
1.5 Pós-injeção
Após a injeção de STZ, deixe os animais livres para beber água e comer. Troque o estofamento todos os dias. Mantenha a gaiola limpa e seca. Evite luz solar forte. Desinfete sempre que possível.
【Observação】Após a injeção de STZ, o nível de glicose no sangue dos animais mostrará três fases: hiperglicemia transitória (1-2 h), hipoglicemia transitória (6-10 h) e hiperglicemia contínua (>72 h). Insulina e glicose devem ser fornecidas adequadamente.
1.6 Remédio de modelagem animal
Para modelos que não atendem aos critérios, STZ pode ser administrado adicionalmente assim que o animal estiver estabilizado (com uma injeção intraperitoneal na dose de 10-20 mg/kg, escolhendo uma dose apropriada com base na situação real), ou esperar até que os níveis de glicose no sangue retornem ao normal e então injetar na dose de rotina. No entanto, para atingir o efeito desejado, muitas vezes é necessário reiniciar o processo de modelagem após retornar a um estado normal.
2 Avaliação de DM induzido por STZ modelos animais
① Características gerais: perda de peso corporal, polidipsia, polifagia e poliúria.
② Glicemia de jejum (FGB), nível sérico de insulina (FINS), tolerância oral à glicose (OGT), insulina sérica de jejum (FSI) e sensibilidade à insulina.
③ Índices bioquímicos séricos: T-Cho, TG, HDL-C, LDL-C, CR, BUN, Alt, etc.
④ Patologia do pâncreas: coloração H&E.
3 Possíveis razões para a falha do modelo DM induzido por STZ
① Má qualidade de STZ. A pureza de STZ para modelagem não deve ser menor que 98% (detecção por HPLC).
② Degradação de STZ. STZ é uma solução fácil de umedecer, deve ser mantida seca, para evitar umidade. O pó evita colocação longa em temperatura ambiente, e o STZ dissolvido é muito instável, com uma meia-vida de pH neutro de 15 min, e deve ser usado no local. Por favor, dissolva o STZ com um valor de pH ácido, de preferência em um banho de gelo.
③ A solução de STZ foi injetada nos intestinos ou outros órgãos.
Se o modelo falhar no padrão DM, é recomendado observar por mais 3 dias. Se ainda falhar, repita o procedimento de injeção.
4 As causas da alta mortalidade de animais induzida por STZ
① Os animais estão abaixo do peso.
② Fornecimento insuficiente de água potável.
③ Hiperglicemia ou hipoglicemia, geralmente hiperglicemia. Isso pode ser aliviado por injeção de insulina ou suplementação temporária de glicose.
Método de suplementação de insulina: por exemplo, se Novolin N ou NPH (insulina neutra de protamina e zinco) for administrada em 2 a 3 unidades de cada vez, a mortalidade geral dos ratos será menor após 3 a 5 dias.
Método de suplementação de glicose: injeção intraperitoneal de 20% de glicose 4 horas após a injeção de STZ pode evitar a morte de ratos devido à baixa glicemia causada pelo jejum.
④ Animais de laboratório matam uns aos outros devido à falta de comida e água.
⑤ Infecção. Animais DM são mais propensos a infecções do que outros, especialmente infecções do trato urinário e infecções abdominais, devido à poliúria. É necessário desinfetar antes e depois de operações invasivas, como injeção intraperitoneal, injeção subcutânea e coleta de sangue. Por exemplo, tetraciclina (ou pomada ocular de aureomicina) pode ser aplicada à ferida após a medição da glicemia a cada vez para prevenir infecções.
5 fatores que afetam a modelagem do diabetes
Os fatores que afetam o modelo da doença diabética incluem a qualidade do reagente de modelagem STZ, a condição dos animais e o método de administração. As principais características de desempenho do reagente incluem pureza, estabilidade e solubilidade. A condição dos animais inclui principalmente histórico genético, sexo, gênero, peso, ambiente de criação e estrutura alimentar. Os métodos de administração incluem tempo de administração, intervalos entre doses e vias de administração. Fatores diferenciados produzem efeitos de modelagem diferenciados.
6 Produto rrecomendação
| Nome do produto | Gato# | Especificação |
| 60256ES60 | 100 mg | |
| 60256ES76 | 500 mg | |
| 60256ES80 | 1 g | |
| Ácido cítrico, Monohidrato | 60347ES25 | 25 g |
| Sal trissódico de ácido cítrico, Dihidratado | 60348ES25 | 25 g |
| Solvente para estreptozocina STZ | 60750ES76 | 500 mL |
[1] Xi Z, et al. Nanopartículas duplamente modificadas superam barreiras de absorção sequencial para administração oral de insulina. J Control Release. 2022 fev;342:1-13. (PMID: 34864116, SE:7.727)