Caros amigos, vocês se sentem perdidos ao enfrentar vários Controle de Carregamento e Anticorpos de Marcação de Epítopo durante o immunoblotting de proteínas? Controle de Carregamento proteínas são codificadas por genes de manutenção em organismos e são expressas de forma estável em vários tecidos. Elas são usadas para verificar se experimentos imunológicos estão ocorrendo normalmente e como um padrão de detecção semiquantitativo para expressão de proteínas. Então, como você escolhe corretamente os anticorpos de controle de carga? Você pode consultar os seguintes pontos.
I. Origem das espécies de amostra
- Para amostras de tecidos ou células de mamíferos, geralmente escolha β-actina, α-tubulina, GAPDH, Lamin-B, Histona H3, Na+/K+-ATPase.
- Para amostras derivadas de plantas, geralmente escolha actina vegetal, Rubisco, etc.
- Para outras amostras com menos pesquisa, escolha a proteína apropriada como referência interna consultando literatura ou bancos de dados relevantes.
Certifique-se de que o peso molecular da proteína alvo seja diferente daquele do controle de carga por mais de 5KDa para evitar interferência durante a detecção. Por exemplo, se a proteína alvo for 40KDa, não é adequado escolher β-actina (42KDa) como um controle de carga. Considere usar GAPDH (36KDa) ou β-tubulina (55KDa) como controle de carga.
III. Sítio de expressão da proteína de referência interna
Nota: Evite as seguintes situações ao usar carregando anticorpos de controle
| Localização subcelular | Controle de Carregamento de Proteína | Peso molecular (KDa) | Notas |
| Citoplasma, célula inteira | β-actina | 42 | Não é adequado para extratos nucleares. A β-actina é um componente dos complexos de remodelação da cromatina; pode não ser adequado para situações em que há diferenças significativas de idade entre os sujeitos da pesquisa. |
| α-tubulina | 55 | Não é adequado para situações em que há diferenças significativas de idade entre os sujeitos da pesquisa. A expressão da tubulina muda com medicamentos antimicrobianos e antimitóticos, portanto, não é adequado ao adicionar medicamentos anticâncer e antifúngicos. | |
| β-tubulina | 55 | ||
| GAPDH | 36 | A hipóxia celular fará com que a expressão de GAPDH aumente, então não é adequado para estudos relacionados ao oxigênio. Fatores como diabetes podem levar ao aumento da expressão de GAPDH. | |
| Vinculina | 117 | Pode ser consultado para proteínas de grande peso molecular. | |
| Mitocôndrias | Série COXIV | 15-17 | Esta série de proteínas é concentrada principalmente em 15-17KDa. Se o peso molecular da proteína alvo for próximo, considere outros anticorpos de controle de carga. |
| HSP60 | 60 |
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| Núcleo | VDAC1/2 | 31-37 | Esta série de proteínas concentra-se principalmente em 31-37 KDa. |
| Lamina B1 | 66 | Não é adequado para células-tronco embrionárias, não é adequado como controle de carga em experimentos de apoptose. | |
| PCNA | 36 | Não é adequado para células não proliferantes. | |
| TBP | 33-43 | O TBP é de 37-43 KDa em humanos e de 33-36 KDa em camundongos e ratos, não sendo adequado para experimentos de apoptose. | |
| AA1 | 65-70 |
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| Histona H3 | 17 | A maioria das proteínas tem um peso molecular de cerca de 17KDa. Se o peso molecular da proteína alvo for próximo, considere outros anticorpos de controle loadong. | |
| Sangue total, soro, plasma | Transferrina | 77 | A expressão é afetada por certos estados de doença e tratamentos, como o ácido retinoico. |
| Albumina | 66 | O conteúdo é extremamente alto, preste atenção na redução da carga amostral em experimentos WB. |
Os anticorpos de rótulo funcionam melhor quando usados juntos
Em experimentos que estudam interações de proteínas, como pull-down, as etiquetas de epítopo podem ser fundidas ao terminal N ou C da proteína alvo por meio de métodos biológicos moleculares. As etiquetas de epítopo comumente usadas incluem His, HA, Myc e GST. Essas etiquetas de epítopo geralmente não afetam a atividade biológica e a localização intracelular da proteína alvo. O surgimento de etiquetas de epítopo proporcionou conveniência para pesquisa científica e produção industrial.
| Etiqueta de epítopo | Sequência de tags | Peso molecular (KDa) |
| Etiqueta HA | YPYDVPDYA | 1.1 |
| Etiqueta Myc | EQKLISEEDL | 1.2 |
| Etiqueta de bandeira | DYKDDDDK | 1 |
| Etiqueta GST | - | 26 |
| Etiqueta GFP | - | 26,9 |
| Etiqueta V5 | GKPIPNPLLGLDST | 1.4 |
| Etiqueta S | KETAAAKFERQHMDS | 1.8 |
| Etiqueta eletrônica | GAPVPYPDPLEPR | 1.4 |
Informações do produto
| Tipo | Nome do produto | Peso molecular (KDa) | Número do produto |
| Carregando anticorpo de controle | β-actina, anticorpo monoclonal de camundongo | 42 | 30101ES |
| β-actina, pAb de coelho | 42 | 30102ES | |
| GAPDH (Clone:1A6), anticorpo monoclonal de camundongo | 36 | 30201ES | |
| GAPDH, pAb de coelho | 36 | 30202ES | |
| α-Tubulina, mAb de camundongo | 50-55 | 30304ES | |
| β-Tubulina, mAb de camundongo | 50-55 | 30301ES | |
| β-Tubulina, pAb de coelho | 50-55 | 30302ES |