1 O princípio de ação da geneticomicina

Genetomycin (Geneticin, G418) é um antibiótico aminoglicosídeo que inibe a síntese de proteínas ao bloquear a extensão da cadeia peptídica ao se ligar aos ribossomos 70S e 80S em células procarióticas e eucarióticas. Esse mecanismo é tóxico para aqueles que incluem bactérias, leveduras, plantas e células de mamíferos. Quando as células foram transfetadas com sucesso e integradas com um gene de resistência à neomicina (como o gene neo), a aminoglicosídeo fosfotransferase codificada pelo gene (APH (3) II) pôde modificar covalentemente G418 para inativá-lo, conferindo resistência às células cultivadas em meio seletivo contendo G418.

Em testes genéticos moleculares, G418 é um dos mais comumente usados ​​para transfecção estável.

2 A aplicação da geneomicina

2.1 Triagem de linhas celulares transfectadas estáveis

• G418 foi usado para rastrear células contendo genes de resistência (por exemplo, genes neo) inibindo a síntese de proteínas. A aminoglicosídeo fosfotransferase codificada pelo gene de resistência inativa G418, o que confere resistência celular a G418. Normalmente, a faixa de triagem de células de mamíferos é de 200 a 2000 μg/mL, com a concentração de trabalho mais comumente usada de 100 a 700 μg/mL. Onde as células vegetais são de 10 a 100 μg/mL e as células de levedura são de 500 a 1000 μg/mL, as seguintes são as concentrações usadas para alguns tipos de células usando G418 como referência.

Célula	Aplicativo	Concentração de ativação de geneomicina (μg/mL)	Trabalhos citados
Espécies de Mucor	a) Cultivadas em meio de crescimento b) Cultivadas em bactérias liofilizadas	a) 10 μg/mL b) 30 μg/mL	Hirth e outros, Proc. Nacional Acadêmico Ciências, v. 79, 7356-7360 (1982).
Mamífero	a) Para triagem b) Para manter o crescimento	a) 400 -1000 μg/mL b) 200 μg/mL	Canaani e Berg, Proc. Nacional Acadêmico Ciências, v. 79, 5166-5170 (1982).
Plantar	a) Para triagem b) Para manter o crescimento	a) 25-50 μg/mL b) 10 μg/mL	Ursic, et al., Bioquímica. Biofísica. Res. Comunicação, v. 101:3, 1031-1037 (1981).
Levedura	a) Para triagem b) Para manter o crescimento	a) 500 μg/mL b) 125-200 μg/mL	Jimenez e Davies, Natureza, v. 287, 869-871 (1980).
Bactérias	Para triagem	16 μg/mL	Waitz e outros, Agentes antimicrobianos. Quimioterápicos., v. 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Knockout de genes e transferência de genes

• No knockout de gene, G418 pode ser usado para rastrear células que knockout com sucesso o gene alvo. Na transferência de gene, G418 facilita a integração de genes estranhos no genoma de células hospedeiras.

2.3 Seleção de resistência em cultura celular

• Durante a cultura celular, o G418 é usado para rastrear células resistentes ao antibiótico, que geralmente carregam genes de resistência específicos.

3 Procedimentos experimentais relevantes para geneomicina

3.1 Preparação da solução estoque G418 (50 mg/mL, concentração ativa)

1) Conversão de Unidades de Atividade

Converta usando a fórmula: (1000/A0) × A1 = A2, onde A0 é a potência do G418, que varia de acordo com o lote. Consulte o relatório de controle de qualidade do lote correspondente ou o rótulo do frasco. A1 é a concentração ativa desejada do G418 a ser preparada. A2 é a concentração real de pó para volume a ser pesada.

Por exemplo, se o lote de G418 tem uma potência de 750 U/mg e você deseja preparar uma concentração ativa de 50 mg/mL, então a concentração real do pó a ser preparada é 1000/750 × 50 mg/mL = 66,67 mg/mL.

Se forem preparados 10 mL de solução estoque G418 (concentração ativa, 50 mg/mL), serão necessários 666,7 mg de pó.

• Esterilização e Armazenamento

Com base no peso real do pó obtido na conversão acima, adicione-o a 10 mL de água deionizada estéril para dissolver completamente.

Primeiro, pré-molhe um filtro de seringa de 0,22 μm com 5 mL de água deionizada estéril, removendo toda a água. Em seguida, filtre usando este filtro para esterilizar e aliquotar em pequenos volumes para uso único (por exemplo, 1 mL) e armazene a -20 °C para estabilidade de 1 ano.

3.2 Estabelecimento da Curva de Morte

1) Dia um: Placas de células não transformadas com densidade celular de 20-25% em placas de cultura apropriadas e incubar durante a noite a 37°C, CO₂.

2) Defina um gradiente de concentração dentro de uma faixa adequada com base no tipo de célula, selecionando pelo menos 6 concentrações (G418 é mais ativo contra células na fase de divisão, então as células devem ser cultivadas por um período antes de adicionar G418), por exemplo, para células de mamíferos, defina 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Segundo dia: Remova o meio de cultura antigo e substitua por meio recém-preparado contendo a concentração correspondente do medicamento, com três repetições para cada concentração.

4) Substitua por meio novo contendo o medicamento a cada 3-4 dias.

5) Realize contagens de células vivas em intervalos fixos (por exemplo, a cada 2 dias) para determinar a concentração apropriada que previne o crescimento de células não transfectadas. Selecione a menor concentração que pode matar a maioria das células dentro do número ideal de dias (geralmente 7-10 dias) como a concentração de trabalho para triagem de linhagem celular transfectada estável.

3.3 Triagem de células transfectadas estáveis

• A Geneticina G418 (60220ES) fornecida pela Yisheng Biotech tem uma eficácia de ≥720 U/mg, uma pureza de ~98% e estabilidade de lote, com um preço de quase um terço dos produtos G418 de outras empresas.
• O meio de triagem contendo os medicamentos foi substituído a cada 3-4 dias.
• A formação de clones celulares (colônias) foi observada e avaliada após 7 dias de seleção. As colônias podem levar uma semana ou mais para se formar, dependendo do tipo de célula hospedeira, transfecção e eficácia da triagem.
• 5-10 clones resistentes foram selecionados e transferidos para placas de cultura de células de 35 mm e mantidos com meio de triagem contendo o fármaco por 7 dias.
• Após a troca do meio de cultura normal.

4 Recomendação de produto

A Geneticina G418 (60220ES) fornecido por Yeasen A biotecnologia tem uma eficácia de ≥720 U/mg, uma pureza de ~98% e estabilidade de lote, com um preço de quase um terço dos produtos G418 de outras empresas.

Especificação	S*	O*	Yeasen	Vantagem de Yeasen
Conteúdo (HPLC)	/	/	~98%	Alta pureza
Potência (U/mg)	≥720 µg/mg	707-721 µg/mg	≥720 µg/mg	Alta eficácia
Preço($/5 g)	~1000	~1000	~200	Barato

5 Caso Experimental

Em E. coli, G69 e G99 foram dois lotes diferentes; as concentrações de genomicina foram de 8 mg/L, 12 mg/L e 16 mg/L, respectivamente, e a concentração mínima efetiva foi de 16 mg/L, o que inibiu completamente o crescimento de bactérias diversas.