1. Como evitar que o RNA seja degradado?

2. O que são inibidores de RNase?

3. O que o inibidor de RNase faz?

4. Quais são as características de um inibidor de RNase murina?

5. Produtos relacionados e desempenho

6. Produtos relacionados

7. Perguntas frequentes

1. Como evitar que o RNA seja degradado?

A RNase desempenha um papel importante no metabolismo do ácido nucleico e pode ser encontrada em quase qualquer tipo de procarioto e eucarioto. A RNase é secretada em fluidos corporais, como lágrimas, saliva e suor, para se defender contra a invasão de microrganismos, e a RNase também está presente em detritos da pele. No entanto, a principal fonte de RNase na maioria dos ambientes são microrganismos, ou seja, bactérias e fungos. A RNase é extremamente difícil de inativar e exibe alta estabilidade, resistência ao calor, resistência a ácidos e resistência a álcalis. Após a desnaturação térmica, ela pode rapidamente recuperar sua estrutura original. A RNase é geralmente muito ativa e é amplamente distribuída em células e tecidos eucarióticos e procarióticos. O RNA na amostra pode se degradar completamente com apenas uma quantidade mínima de contaminação por RNase. A contaminação por RNase em estudos pode vir de fontes internas e externas. A RNase em células é principalmente uma fonte endógena de contaminação, enquanto fontes exógenas incluem suprimentos experimentais, o ambiente de laboratório e os próprios experimentadores. RNases, especialmente membros da família RNase A, são proteínas pequenas e compactas contendo alguns resíduos de cisteína capazes de formar muitas ligações dissulfeto intramoleculares. Após retornar à temperatura ambiente, na ausência de um agente desnaturante, a RNase desnaturada restaurará sua estrutura natural e algumas funções. Portanto, as RNases retêm atividade considerável após ciclos repetidos de congelamento e descongelamento, mesmo após a autoclavagem. A natureza estável dessas enzimas as torna resistentes a muitos métodos de descontaminação, que geralmente exigem métodos químicos agressivos para eliminar RNases de superfícies e soluções.

Para evitar a degradação do RNA vulnerável, precauções especiais devem ser tomadas ao trabalhar com RNA. Para controlar a RNase exógena, o operador precisa usar luvas durante o experimento e trocá-las após tocar na pele, maçanetas e na superfície de objetos comuns. E o operador precisa usar uma pistola de pipeta especial para operação de RNA e usar pontas de parede, tubos de centrífuga, compostos e reagentes sem RNase. Mantenha-se afastado ou cubra orifícios de ventilação e janelas abertas e use áreas menos movimentadas como áreas sem RNase. E durante a extração e análise de RNA, não realize outros experimentos que possam causar contaminação por RNase.
O método de inibição da atividade da RNase endógena é, primeiramente, preservar a amostra. Após a coleta do tecido, o RNA não deve ser extraído diretamente. Em vez disso, ele deve ser rapidamente congelado e armazenado em um ambiente de -80°C com nitrogênio líquido a tempo, e o experimento deve ser realizado o mais rápido possível para minimizar a degradação do RNA.Inibidores de RNase são adicionados ao lisado celular para simultaneamente quebrar as células e inativar a RNase, minimizando a atividade da RNase liberada durante a quebra celular. Todos os reagentes e equipamentos devem ser especialmente tratados para inativar RNases antes do uso.

Além disso, os inibidores de RNA podem ser usados ​​para inibir a atividade da RNase e prevenir a degradação do RNA pela RNase. Existem vários tipos de inibidores de RNA:

• Pirocarbonato de dietila (DEPC): É um inibidor forte, mas não completo, da RNase. Ele desnatura a proteína por meio da combinação do anel imidazol da histidina no grupo de genes ativos da RNase, inibindo assim a atividade da enzima.
• Isotiocianato de guanidina: atualmente considerado o inibidor de RNase mais eficaz, ele também pode inativar a RNase durante a lise do tecido, o que pode destruir a estrutura celular e dissociar o ácido nucleico da nucleoproteína, além de ter um certo efeito na RNase. Forte efeito desnaturante.
• Complexo de ribonucleosídeo de vanádio: um complexo formado por íons de óxido de vanádio e nucleosídeos, que podem se combinar com a RNase para formar um análogo transicional, inibindo quase completamente a atividade da RNase.
• Inibidor proteico da RNase (RNasina): uma glicoproteína ácida extraída do fígado de rato ou do blastodisco humano, a RNase é um inibidor não competitivo da RNase, que pode se ligar a uma variedade de RNases, tornando-a inativa.
• Outros: SDS, ureia, terra diatomácea, etc. também têm um certo efeito inibitório sobre a RNase.

2. O que são inibidores de RNase?

Inibidores de RNase são uma classe de substâncias que podem inibir a atividade de RNase. Inibidores comuns de RNase incluem Dietil Pirocarbonato (DEPC), Isotiocianato de Guanidina, Complexos de Ribonucleosídeo Vanadil (RVC) e inibidores de proteína de RNase (RNasina). Entre eles, DEPC e isotiocianato de guanidina têm certa toxicidade, e o RVC tem um efeito inibitório na polimerase de PCR, o que não é propício para experimentos subsequentes. RNasina não é tóxica e é um inibidor não competitivo de RNase, que pode se ligar a várias RNases para inativá-las.

3. O que o inibidor de RNase faz?

Os inibidores de RNase são comumente usados ​​como uma medida de precaução em manipulações enzimáticas de RNA para inibir e controlar tais contaminantes. RNasin é uma glicoproteína ácida extraída do fígado de rato ou blastoderme humano, que pode se ligar especificamente à RNase de uma maneira não covalente para formar um complexo, causando a inativação da RNase, protegendo assim a integridade do RNA. Atualmente, o Inibidor de RNase ajuda a prevenir a degradação do RNA em aplicações como síntese de cDNA, RT-PCR, reações de transcrição/tradução in vitro ou purificação de RNA.

4. Quais são as características de um inibidor de RNase murina?

Os inibidores de RNase murina recombinantes não contêm 2 cisteínas sensíveis à oxidação que estão contidas em inibidores de RNase de origem humana. Portanto, o inibidor de RNase murina tem alta atividade antioxidante e é mais estável para experimentos de DTT baixo. Além disso, o inibidor de RNase murina de Yeasen tem as seguintes características:
1) Inibição geral da RNase: O inibidor de RNase murino YEASEN inibe especificamente a RNase A, RNase B, RNase C e assim por diante.
2) Condições de reação versáteis: o inibidor de RNase é ativo em pH 5,0-9,0 e 25℃-55℃, o que é adequado para transcriptase reversa termoestável.
3) Vários experimentos posteriores são possíveis: Nenhuma inibição da atividade da polimerase é observada quando o inibidor de RNase é usado com Taq DNA polimerase, AMV ou transcriptase reversa M-MuLV ou RNA polimerases de fago (SP6, T7 ou T3).
4) Produtos produzidos em massa: uma única capacidade de fabricação de 2 bilhões de U é útil para o gerenciamento de custos, garantindo homogeneidade do produto, estabilidade do fornecimento e pontualidade.
5) Consistência entre lotes: plataforma de expressão e purificação de proteínas maduras pelo sistema de gestão de qualidade ISO13485, testes de controle de qualidade por requisitos de qualidade para garantir a estabilidade do produto entre lotes.

5. Produtos relacionados e desempenho

A. O inibidor de RNase bloqueia a atividade de RNase

1μg de RNA total de células HEK, 1μL de inibidor de RNase pode inibir efetivamente 5ng de RNase.

Figura 1. Efeito inibitório do inibidor de RNase murina.

B. Inibidor de RNase supera produtos estrangeiros em testes de qPCR

O impacto inibitório dos inibidores de RNase derivados de camundongo (MRI) da Yeasen and R* Company foi medido usando a técnica qPCR sob circunstâncias experimentais idênticas, e o inibidor de RNase da fonte murina YEASEN inibiu eficientemente a RNase A no sistema. O impacto da inibição foi superior ao dos concorrentes.

Figura 2. Teste de inibição de RNase R* MRI

Nota: As curvas na figura da esquerda para a direita são: Controle positivo (somente RNA, sem RNase e RNM), RNM de 40 U, ​​RNM de 30 U, RNM de 20 U, RNM de 10 U e Controle negativo (RNA + RNase, sem RNM).

Figura 3. Teste de inibição de RNase por ressonância magnética de Yeasen

Nota: As curvas na figura da esquerda para a direita são: Controle positivo (somente RNA, sem RNase e RNM), RNM de 80 U, RNM de 60 U, RNM de 40 U, ​​RNM de 30 U, RNM de 20 U, RNM de 10 U, Controle negativo (RNA+RNase, sem RNM).

Figura 4. TC dos resultados de RT-qPCR de Yeasen MRI e R* MRI

6. Produtos relacionados

Os produtos relacionados que a Yeasen pode fornecer são mostrados na Tabela 1:

Tabela 1.Lista de produtos

7. Perguntas frequentes

P1: Haverá RNase no inibidor de RNase murina?
R: Cada reagente detectará a atividade da RNase para garantir que o inibidor da RNase murina não traga contaminação por RNase.
P2: Os inibidores de RNase murina terão impacto nos experimentos de PCR posteriores?
R: Não terá efeito. Cada lote de inibidor de RNase murina está livre de contaminação genômica após testes de qualidade e pode ser usado em pesquisas de RT-PCR e RT-qPCR.
Q3: O inibidor da RNase murina será inativado?
R: Os inibidores serão inativados em temperaturas acima de 65°C, e agitação vigorosa também causará inativação.
P4: Quais precauções devem ser tomadas ao usar um inibidor de RNase murina para preparar o sistema de reação?
Resposta: Ao preparar o sistema, um inibidor de RNase pode ser adicionado primeiro antes que outros componentes que podem introduzir fontes de contaminação por RNase sejam adicionados.
Q5: O inibidor de RNase murina tem atividade de endonuclease e exonuclease?
Resposta: Não há atividade de endonuclease e exonuclease, o que ajuda a melhorar o rendimento do produto.

Sobre a leitura:

Inibidores de RNase murina ——Elimine com sucesso a contaminação da RNase e preserve o RNA

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