RNase HII, também conhecida como RNase H2, é uma endorribonuclease que visa especificamente e corta a ligação fosfodiéster na extremidade 5' de um ribonucleotídeo solitário aninhado dentro de uma hélice de DNA fita dupla, produzindo um fosfato 5' e um grupo hidroxila 3' (Fig 1). Esta enzima exibe atividade de clivagem mínima em relação ao RNA fita simples e é inativa contra DNA fita dupla (dsDNA) e DNA fita simples (ssDNA). Funcionalmente ativa dentro da faixa de temperatura de 50 °C a 75 °C, a RNase HII atinge o desempenho máximo em temperaturas entre 70 °C e 75 °C. Aproveitando sua capacidade única de realizar clivagem direcionada de sítio único em sítios de DNA onde um ribonucleotídeo é integrado, sem afetar dsDNA ou ssDNA, a RNase HII serve como um "gatilho" de precisão para iniciação de reação, incluindo ativação e extensão de primer, para atingir amplificação específica. Esta enzima desempenha um papel fundamental na PCR dependente de RNase H (rhPCR), na tecnologia de amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) e na degradação de componentes de RNA em fragmentos de Okazaki.
Fig 1. Diagrama esquemático do princípio da reação da RNase HII
As aplicações funcionais da RNase HII
一. PCR dependente de RNase H(PCR em tempo real)
O rhPCR incorpora RNase HII e primers rhPCR cliváveis fechados especialmente projetados no processo de PCR. Essa abordagem aproveita a propriedade única da RNase HII de hidrolisar seletivamente o RNA dentro de híbridos DNA-RNA, enquanto deixa as ligações fosfodiéster em DNA e RNA de fita simples ou dupla intactas. Como resultado, a RNase HII digere apenas o híbrido DNA-RNA e permite a extensão do primer quando o primer é perfeitamente complementar à sequência de DNA alvo. Essa ação direcionada aumenta significativamente a precisão da reação. A RNase HII é a única enzima capaz de iniciar a remoção precisa de ribonucleotídeos sem induzir mutações por clivagem na extremidade 5' do ácido ribonucleico. Devido à sua alta especificidade, sensibilidade e reprodutibilidade, a rhPCR oferece vantagens distintas em aplicações como detecção de polimorfismo de nucleotídeo único (SNP), tipagem genética, detecção simultânea de múltiplos alvos e análise de ácido nucleico ambiental.
Rota Técnica
1. Projeto de Primer
O design do primer deve garantir que a temperatura de fusão após o corte seja maior do que a temperatura de anelamento para garantir que o primer se ligue de forma estável ao molde durante os ciclos de PCR. O primer rhPCR consiste em três partes:
Segmento de DNA 1）5': comparável em comprimento e requisitos de temperatura de fusão (Tm) aos primers de PCR padrão, ele pode efetivamente parear e se estender a partir do DNA molde após ser cortado pela enzima RNase HII.
2）Uma única base de RNA: fornecendo um local de corte para a RNase HII.
3）Segmento 3' de DNA: Um comprimento de quatro ou cinco bases com um bloqueador, normalmente uma molécula curta e não extensível, como o propilenoglicol, que impede a extensão da DNA polimerase até que o bloqueador seja removido.
2. Corte e extensão
No início da reação de rhPCR, o primer e o DNA molde estão livres. Quando o primer se liga ao molde heteroduplex RNA:DNA específico, o lado 5' da base de RNA do primer bloqueado é reconhecido e cortado pela enzima RNase HII, deixando um oligonucleotídeo de DNA com um grupo 3'-hidroxila, fornecendo um ponto de partida para a DNA polimerase se estender. Isso é seguido pelo processo de amplificação de PCR convencional.
Fig 2. Diagrama do princípio rhPCR [1]
Sim.Amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP)
A amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP) é um método simples e rápido para amplificação de genes que pode amplificar ácidos nucleicos sob condições isotérmicas em um curto período de tempo. No entanto, devido ao início da atividade da DNA polimerase durante a preparação em temperatura ambiente, incompatibilidades não específicas são formadas, o que pode levar a uma pequena quantidade de pareamento incorreto e dímeros de primer, causando pequenas contaminações que podem resultar em falsos positivos.
A aplicação da RNase HII ao sistema de amplificação LAMP pode efetivamente abordar a questão dos falsos positivos na tecnologia LAMP, ampliando sua aplicação em diagnósticos clínicos. Conforme mostrado na Fig. 3, o método LAMP ativado por primer (PA-LAMP) usando RNase HII, quando o primer pareia com o ssDNA alvo, a enzima RNase HII cliva especificamente o RNA no primer, ativando-o e permitindo a extensão do primer, alcançando amplificação específica e reduzindo efetivamente os falsos positivos no sistema.
Fig 3. Diagrama esquemático do princípio PA-LAMP [2]
YEASEN RNase HII
RNase HII de YEASEN (Cat#14539) é derivado de Pyrococcus abyssi, Pensilvânia, e é livre de nucleases contaminantes, enzimas de corte e resíduos de RNase, com baixa contaminação do DNA hospedeiro, reduzindo efetivamente os falsos positivos no sistema. A RNase HII da YEASEN é extremamente resistente ao calor, mantendo sua atividade mesmo após 30 minutos a 95 °C, tornando-a compatível com vários sistemas de reação rhPCR e também adequada para LAMP e outras aplicações.
1. E. coli resíduo de DNA genômico < 0,5 cópias/100 U
Detecção de E. coli resíduos de DNA genômico em diferentes lotes de RNase HII mostraram que o resíduo de DNA genômico hospedeiro da RNase HII de YEASEN está muito abaixo de 0,5 cópias/100 U.
Fig 4. Detecção de E. coli resíduo de DNA genômico
2. Teste de resistência ao calor de 95 °C
Após aquecer a RNase HII a 95°C por 0 a 45 minutos, a atividade enzimática da RNase HII foi testada. Os resultados indicaram que quase não houve perda de atividade enzimática na RNase HII da YEASEN mesmo após 45 minutos de aquecimento.
Fig 5. Teste de resistência ao calor de 95°C
3. Sem exonuclease, enzima de corte ou resíduo de RNase (dose de 1 U)
Incubando 1 U de diferentes lotes de RNase HII com seus respectivos substratos DNA/RNA a 37°C por 4 horas, os resultados da eletroforese em gel de agarose indicaram que não havia exonuclease, enzima de corte ou resíduo de RNase na RNase HII.
Figura 6.Resultados de detecção de exonuclease, enzima de corte e resíduo de RNase
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Referências
[1] Dobosy JR, Rose SD, Beltz KR, Rupp SM, Powers KM, Behlke MA, Walder JA. PCR dependente de RNase H (rhPCR): especificidade melhorada e detecção de polimorfismo de nucleotídeo único usando primers cliváveis bloqueados. BMC Biotechnol. 2011 10 de agosto;11:80. doi: 10.1186/1472-6750-11-80.
[2] Du WF , Ge JH , Li JJ ,et al. Detecção de alta especificidade em uma única etapa de mutação de nucleotídeo único por amplificação isotérmica mediada por loop ativável por primer (PA-LAMP)[J]. Analytica chimica acta, 2019(1050-):1050.DOI:10.1016/j.aca.2018.10.068.