Figura 1. Diagrama esquemático da DNase I clivando dsDNA na presença de Mg²⁺ e Mn²⁺

A DNase I comum é principalmente purificada do pâncreas bovino ou é uma enzima recombinante. Comparada à DNase I purificada do pâncreas bovino, a DNase I recombinante tem níveis de RNase endógena relativamente mais baixos ou pode ser formulada como produtos livres de RNase, tornando-a mais adequada para aplicações sensíveis a RNase, como a remoção de DNA de amostras de RNA.

Aplicações

Em relação às aplicações, a DNase I é bem conhecida por seu uso em experimentos relacionados à manutenção da integridade do RNA, como extração de RNA livre de DNA, preparação de moldes de RNA sem gDNA antes da transcrição reversa e degradação de moldes de DNA após transcrição in vitro. Além disso, pode ser usada para digerir sondas de DNA na remoção de rRNA, para marcação de DNA por meio de tradução de nick, análise de interações DNA-proteína usando o método footprinting, geração de bibliotecas de DNA aleatórias, redução da viscosidade de lisados ​​celulares ou extratos proteicos, digestão de adesões celulares como um aditivo em cultura celular e clivagem parcial de DNA genômico como um controle positivo em ensaios TUNEL para detecção de apoptose. Em resumo, a DNase I pode ser usada em quase qualquer aplicação que exija digestão enzimática de DNA. Abaixo, uma breve introdução a várias aplicações comuns será fornecida.

• Remoção de gDNA antes da extração de RNA ou transcrição reversa

O RNA, como uma amostra comumente estudada em laboratórios, influencia muito a qualidade dos dados experimentais devido à sua própria qualidade. Geralmente é impossível evitar completamente o resíduo de gDNA durante o processo de extração de RNA. Portanto, antes de conduzir aplicações downstream desafiadoras (como análise de expressão de mRNA, análise de transcriptoma, etc.), geralmente é recomendado tratar amostras de RNA com DNase I para digerir o gDNA residual. A digestão do gDNA pode ser realizada durante a extração de RNA, após a extração de RNA ou antes da transcrição reversa do RNA.

Figura 2. Processo de remoção de gDNA baseado em DNase I

• Remoção do DNA molde na transcrição in vitro

A transcrição in vitro (IVT) usa principalmente DNA como um molde para produzir RNA sob a influência de substratos e tampões apropriados. As RNA polimerases comumente usadas neste processo incluem T7, T3 e SP6, que são responsáveis ​​por catalisar a síntese de RNA. No entanto, o produto de RNA sintetizado pode conter resíduos de DNA, e eliminar esses resíduos é benéfico para experimentos posteriores.

Especialmente no processo de desenvolvimento de vacinas de mRNA, a remoção desses resíduos de DNA é uma etapa crítica que afeta diretamente a dificuldade dos processos de purificação subsequentes e a pureza do produto final.Para eliminar eficientemente o DNA molde, a DNase I é normalmente usada no tratamento para garantir que a amostra de RNA esteja livre de resíduos de DNA, uma etapa que ajuda a melhorar a precisão e a eficiência geral do experimento.

Figura 3: Processo de transcrição in vitro usando plasmídeo linearizado como molde^[4]

• Remoção de rRNA na construção e sequenciamento de biblioteca de RNA

Em organismos, o rRNA é altamente abundante e altamente conservado, o que é de pouca importância para a obtenção de pesquisa de informações biológicas. No entanto, 95% do RNA total extraído durante os experimentos é rRNA humano, e a presença desses rRNAs pode interferir na detecção de RNAs alvo. Portanto, na preparação e sequenciamento da biblioteca de RNA, o rRNA é geralmente removido primeiro. Atualmente, o principal método para remoção de rRNA é a digestão por RNAase, e sua principal operação os passos e princípios são os seguintes:

1. Extrair RNA total;
2. Hibridizar sondas de DNA fita simples com moléculas de rRNA (Nota: Projetar e sintetizar sondas de DNA fita simples específicas para rRNA);
3. A RNase H degrada o rRNA hibridizado;
4. A DNase I degrada as sondas de DNA;
5. O rRNA é removido com sucesso, deixando para trás modelos de RNA não-rRNA.

Figura 4: Diagrama esquemático do princípio de remoção de rRNA baseado no método enzimático^[5]

• Tradução de Nick para marcação de DNA

A tradução de Nick é o método mais comumente usado para rotular sondas de ácido desoxirribonucleico em laboratório. Este método é obtido por meio da ação combinada da DNase I e E. coli DNA Polimerase I.

O princípio principal é o seguinte:

1. Primeiro, use uma concentração apropriada de DNase I para criar vários cortes de fita simples em cada fita do DNA fita dupla a ser marcado, formando terminais hidroxila 3' nos locais dos cortes.
2. Em seguida, use a atividade de exonuclease 5'→3' de coliA DNA polimerase I remove um nucleotídeo da extremidade 5' do entalhe, enquanto a atividade da polimerase 5'→3' de E. coli A DNA Polimerase I introduz um nucleotídeo marcado na extremidade 3' do nick para repará-lo. Conforme o nick se move ao longo da fita de DNA, os nucleotídeos marcados são incorporados à fita de DNA recém-sintetizada.

Figura 5: Diagrama esquemático do princípio da marcação de DNA por tradução de nick^[6]

• Experimento de ensaio de pegada de DNase I

O ensaio de footprinting da DNase I é um método preciso para identificar os sítios de ligação de proteínas de ligação ao DNA em moléculas de DNA. O princípio é que proteínas ligadas a um fragmento de DNA protegem a região ligada de ser degradada pela DNase I. Após a digestão enzimática, o fragmento restante (o "footprint") pode ser usado para determinar sua sequência. Na imagem do gel, não há bandas correspondentes às regiões onde a proteína está ligada.

O princípio principal é o seguinte:

1. Rotule as extremidades de fita simples da molécula de DNA de fita dupla a ser testada.
2. Misture a proteína com DNA e adicione uma quantidade apropriada de DNase I para digestão enzimática, formando fragmentos de DNA de comprimentos variados.A quantidade de enzima deve ser controlada para garantir que os fragmentos de DNA adjacentes difiram em apenas um nucleotídeo, e um controle sem proteína adicionada deve ser incluído em paralelo.
3. Remova a proteína do DNA, separe o DNA desnaturado por eletroforese PAGE e faça a autorradiografia para interpretar a sequência de nucleotídeos da região da pegada em comparação com o grupo de controle.

Figura 6: Diagrama esquemático do princípio do ensaio de footprinting da DNase I^[7]

O DNase I Guia de Seleção de Yeasen

Para atender a diversas necessidades de aplicação, a Yeasen oferece recombinant DNase I em E. coli, e pode fornecer DNase I de grau GMP para atender aos requisitos de transcrição de mRNA in vitro e outras aplicações.

Posicionamento do produto	Aplicativo	Nome do produto	número de catálogo
RNase livre	remoção de DNA de preparações de RNA e proteínas	DNase I recombinante (sem RNase)	10325ES
Grau GMP, RNase livre	Transcrição in vitro de mRNA	UCF.ME® Desoxirribonuclease I (DNase I) grau GMP	10611ES

Referências

[1] Ndiaye C, Mena M, Alemany L, et al. Detecção de DNA do HPV, mRNA E6/E7 e p16INK4a em cânceres de cabeça e pescoço: uma revisão sistemática e meta-análise[J]. The Lancet Oncology, 2014, 15(12): 1319-1331.

[2] Broccolo F, Fusetti L, Rosini S, et al. Comparação da carga de DNA viral específica do tipo HPV oncogênico e detecção de mRNA E6/E7 em amostras cervicais: resultados de um estudo multicêntrico[J]. Journal of medical virology, 2013, 85(3): 472-482.

[3] Huang Z, Fasco MJ, Kaminsky L S. Otimização da remoção de DNA contaminante de RNA pela Dnase I para uso em RNA-PCR quantitativo[J]. Biotechniques, 1996, 20(6): 1012-1020.

[4] Kang DD, Li H, Dong Y. Avanços do mRNA transcrito in vitro (mRNA IVT) para permitir a tradução para as clínicas[J]. Advanced Drug Delivery Reviews, 2023, 199: 114961.

[5] Wiame I, Remy S, Swennen R, et al. Inativação irreversível da DNase I pelo calor sem degradação do RNA[J]. Biotechniques, 2000, 29(2): 252-256.

[6] Adolph S, Hameister H. Tradução de nick in situ de cromossomos metafásicos com d-UTP[J] marcado com biotina. Genética humana, 1985, 69: 117-121.

[7] Song C, Zhang S, Huang H. Escolha de um método adequado para a identificação de origens de replicação em genomas microbianos. Front Microbiol, 2015, 6: 1049.