- Fundo
Os dados resumidos neste relatório são realizados pela
Os dados resumidos são apenas para referência do usuário, e o usuário precisa verificar o método de micoplasma usando suas próprias amostras para confirmar se o método pode atender aos requisitos do usuário. Todos os laboratórios que usam este kit são recomendados a verificar os seguintes parâmetros: Limite de detecção, Especificidade e Robustez.
Conteúdo de validação:
| Desempenho | Parâmetros de validação | Resultados da validação |
| Limite de detecção | Limite de detecção de cepas de micoplasma | Limite de detecção para 10 tipos de micoplasma farmacopeico: 10 UFC/mL, cada um testado 24 vezes com uma taxa de detecção de ≥95%. |
| Especificidade | Interferência de matriz de amostra | Foram testadas 9 matrizes de amostras diferentes e soluções de diluição de DNA, mas nenhum micoplasma foi detectado. |
| Reatividade cruzada | Foram testadas 14 cepas e 6 células de engenharia comumente usadas em biofármacos, mas nenhum micoplasma foi detectado. | |
| Durabilidade | Estabilidade de congelamento e descongelamento | Pode suportar 20 ciclos repetidos de congelamento e descongelamento sem afetar o desempenho do kit. |
| Estabilidade de aceleração térmica | Não afetado em condições de 37°C por 14 dias e 4°C por 30 dias. | |
| Compatibilidade de Instrumentos | Compatível com ABI7500, ABI QuantStudio™5, Bio-Rad CFX96 e Roche LightCycler®480. | |
| Cobertura | Cobertura de tipos de DNA de micoplasma | A comparação de bancos de dados usando sequências de rRNA 16S de micoplasma abrange 183 espécies dentro da classe Mollicutes. |
- Materiais e métodos experimentais
2.1 MeucAwayTM Kit de detecção de qPCR em tempo real de micoplasma (2G), Fornecedor:
2.2 MolPuroTM Kit de preparação de amostra de DNA residual magnético, fornecedor:
2.3 Os padrões de sensibilidade de Mycoplasma são adquiridos da Minerva Biolabs (MB), cujas cepas são da National Collection of Type Cultures (NCTC). Os padrões de sensibilidade são micoplasmas inativados e usados para a verificação metodológica do método de amplificação de ácido nucleico (método qPCR/PCR) para detecção de micoplasma. São adquiridos no total 10 tipos de micoplasmas, incluindo os requisitos do EP 2.6.7 e JP G3. As informações dos padrões são as seguintes:
| Fornecedor | Cat No. | NCTC No. | ATCC Não. | Nome do material |
| Minerva Biolabs (MB) | 102-1003 | 10129 | 23838 | 10 UFC™ Padrão de sensibilidade Mycoplasma arginini |
| 102-2003 | 10112 | 23714 | 10 UFC™ Padrão de sensibilidade Mycoplasma orale | |
| 102-3003 | 10115 | 19610 | 10 UFC™ Padrão de sensibilidade Mycoplasma gallisepticum | |
| 102-4003 | 10119 | 15531 | 10 UFC™ Padrão de sensibilidade Mycoplasma pneumoniae | |
| 102-5003 | 10124 | 25204 | 10 UFC™ Padrão de sensibilidade Mycoplasma synoviae | |
| 102-6003 | 10117 | 19989 | 10 UFC™ Padrão de sensibilidade Mycoplasma fermentans | |
| 102-7003 | 10130 | 17981 | 10 UFC™ Padrão de sensibilidade Mycoplasma hyorhinis | |
| 102-8003 | 10116 | 23206 | 10 UFC™ Padrão de sensibilidade Acholeplasma laidlawii | |
| 102-9003 | 10164 | 27556 | 10 UFC™ Padrão de sensibilidade Spiroplasma citri | |
| 102-11003 | 10113 | 23064 | 10 UFC™ Padrão de sensibilidade Mycoplasma salivarium |
2.4 Dados originais: a versão eletrônica foi registrada no 'Relatório Experimental' o subarquivo do arquivo pai 'MycAwayTM Kit de detecção de qPCR em tempo real de micoplasma (2G).
2.5 Métodos: Os materiais e métodos de operação usados para o experimento foram basicamente produzidos ou definidos pela
- Conteúdos e resultados da qualificação
3.1 Limite de detecção (LOD)
A extração de ácido nucleico, bem como a detecção da cepa padrão de Mycoplasma de 10 UFC/mL, foi realizada de acordo com as instruções para a cepa padrão, bem como as instruções para o kit de extração e detecção. Um total de 24 ensaios foram obtidos para a cepa padrão de Mycoplasma de 10 UFC/mL. Amostras NCS (Amostra de Controle Negativo) e NTC (Controle Sem Molde) foram testadas simultaneamente em cada experimento.
Os resultados mostraram que os resultados do NCS e do NTC foram satisfatórios, e todas as 24 amostras de 10 UFC/mL apresentaram resultados positivos, atendendo ao requisito de ter pelo menos 23 resultados positivos em 24 testes.
| Não. | Nome do material | Concentração de líquido bacteriano |
| 1 | Mycoplasma arginini | 10 UFC/mL |
| 2 | Mycoplasma orale | 10 UFC/mL |
| 3 | Mycoplasma gallisepticum | 10 UFC/mL |
| 4 | Mycoplasma pneumoniae | 10 UFC/mL |
| 5 | Mycoplasma synoviae | 10 UFC/mL |
| 6 | Mycoplasma fermentans | 10 UFC/mL |
| 7 | Mycoplasma hyorhinis | 10 UFC/mL |
| 8 | Acholeplasma leigoslawii | 10 UFC/mL |
| 9 | Spiroplasma citri | 10 UFC/mL |
| 10 | Mycoplasma salivarium | 10 UFC/mL |
Tabela 1 Informações sobre cepas validadas
| 10 UFC/mL | Experimento 1 | Experimento 2 | Experimento 3 |
| Taxa de detecção | 8/8 | 8/8 | 8/8 |
| Total | 24/24 | ||
Tabela 2 Resultados do limite de detecção
3.2 Especificidade
3.2.1 Faixa de teste de micoplasma
As sequências de sondas de primers no kit foram comparadas com o genoma 16S rRNA no banco de dados. Por meio de análise de bioinformática, obteve-se que o MycAwayTM O kit de detecção de qPCR de Mycoplasma (método de sonda) da NextSense Biologicals pode cobrir pelo menos 183 espécies de Zooxanthellae, incluindo 120 Mycoplasma, 9 Ureaplasma, 33 Spiroplasma e 7 Cholestrongyla, e assim por diante.
3.2.2 Interferência da matriz de amostra
9 substratos (MEM de Dulbecco, Meio F-10 de Ham, Meio M-199, Meio F-12K de Ham Kaighn, Meio RPMI-1640, Meio 5A de McCoy, Meio F-12K de Ham Kaighn+1,0 mM/L de Glutamina, Meio L-15 LEIBOVITZ MEDTA +2,05 mM L-Glutamina, Meio Padrão DMEM-baixo teor de glicose) são usados como amostras para verificar a interferência da matriz da amostra, os resultados mostraram que o meio não tem interferência nos reagentes do kit.
3.2.3 Faixa de detecção de flexibactérias
A extração e detecção de micoplasma inativado (Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma gallisepticum, Mycoplasma pneumoniae, Mycoplasma synoviae, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hyorhinis, Acholeplasma laidlawii, Spiroplasma citri, Mycoplasma salivarium) a 10 UFC/mL são necessárias, juntamente com testes de amostra NCS e NTC.
Os resultados mostraram que NCS e NTC não foram detectados e os resultados foram negativos; todas as 10 espécies de micoplasma foram detectadas e os resultados foram positivos.
3.2.4 Reação cruzada
Para 14 cepas não flexibacterianas, incluindo Clostridium (Clostridium perfringens, Clostridium acetobutylicum), Lactobacillus (Lactobacillus acidophilus), Streptococcus (Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae), vários outros microrganismos comuns bacillus-coccus-fungi (Staphylococcus epidermidis, Acinetobacter baumannii, Enterobacter aerogenes, Micrococcus garciniae, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonalbacterium leucocephala, Salmonella enterica enteritidis subsp. enterica, Bacillus subtilis, Bacillus subtilis e Bacillus sp. Bacillus cereus, Bacillus cereus) e seis células modificadas (HEK293, 293T, Vero, CHO, E. coli, SF9) foram usadas para detecção de micoplasma usando o MolPureTM Método de esferas magnéticas para kit de pré-processamento de amostras de DNA residual (frascos) e MycAwayTM Kit de detecção de qPCR de micoplasma (método de sonda) (2G), e cada experimento foi realizado simultaneamente com os testes de amostra PCS, NCS e NTC.
Os resultados mostraram que os resultados de PCS, NCS e NTC foram satisfatórios; as amostras de teste foram negativas e não ocorreu reatividade cruzada.
3.3 Robustez
3.3.1 Estabilidade de congelamento e descongelamento
O kit de teste de micoplasma foi submetido a experimentos de congelamento e descongelamento sob condições de -25℃~-15℃, e os resultados mostraram que o kit foi capaz de suportar 20 congelamentos e descongelamentos repetidos, e seu desempenho não foi afetado.
3.3.2 Estabilidade Acelerada
O kit de detecção de micoplasma foi acelerado por calor a 37℃ por 14 dias e a 4℃ por 30 dias, respectivamente, e os resultados mostraram que o desempenho do produto não foi afetado.
3.3.3 Aplicabilidade do instrumento
Para o kit de detecção de micoplasma, diferentes concentrações de controle positivo e DNA de Mycoplasma pneumoniae no kit foram usadas como amostras a serem testadas, e os experimentos foram realizados em quatro marcas e modelos diferentes, a saber, Thermo Scientific ABI7500, Thermo Scientific ABI Q5, Shanghai Hongshi SLAN-96S e Roche LightCycler®480, respectivamente.Os experimentos foram realizados em instrumentos qPCR de quatro marcas e modelos diferentes, Shanghai Hongshi SLAN-96S e Roche LightCycler®480.
Os resultados mostraram que as amostras a serem testadas foram detectadas em instrumentos qPCR de modelos de diferentes fabricantes e os resultados do controle negativo foram qualificados, e o desempenho do kit não foi afetado.
- 4.Referência
4.1 Método de exame de micoplasma <3301>. Farmacopeia Chinesa, Parte III [S]. Pequim: China Science and Technology Press, 2020: 542-543.
4.2 Diretrizes para validação de métodos analíticos <9101>. Farmacopeia Chinesa, Parte III [S]. Pequim: China Science and Technology Press, 2020: 682.
4.3 Diretrizes para validação de métodos alternativos para testes microbiológicos de produtos farmacêuticos <9201>. Farmacopeia Chinesa, Parte III [S]. Pequim: China Science and Technology Press, 2020: 684.
4.4 Micoplasmas. Farmacopeia Europeia[S]. 10ª Edição, 2020: Seção 2.6.7, 194-199.
4.5 Teste de micoplasma para substratos celulares usados para a produção de produtos biotecnológicos/biológicos <G3-14-170>. Farmacopeia[S] japonesa. 18ª edição, 2021: 2678-2682.
4.6 Erica J. Fratz-Berilla, Phillip Angart, Ryan J. Graham, et al. Impactos em atributos de qualidade de produto de anticorpos monoclonais produzidos em culturas de biorreatores de células CHO durante eventos de contaminação intencional por micoplasma. Biotecnologia e Bioengenharia. 2020;117(9): 2802-2815.
4.7 Dmitriy V. Volokhov, Laurie J Graham, Kurt A Brorson, Vladimir E Chizhikov. Teste de micoplasma de substratos celulares e biológicos: Revisão de técnicas não microbiológicas alternativas. Mol Cell Probes. 2011 Abr-Jun;25(2-3):69-77.
4.8 AL Ingebritson, CP Gibbs, C. Tong, GB Srinivas. Um método de detecção de PCR para testar contaminação por Mycoplasma de vacinas veterinárias e produtos biológicos. Lett em Microbiologia Aplicada. 2015 fev;60(2):174-180.
Informações para pedidos
| Descrição | Número da peça |
| Kit de preparação de amostra de DNA residual magnético MolPure® | 18461ES |
| Kit de detecção de qPCR de micoplasma MycAway™ (2G) | 40619ES |