CHO Kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras (3G)
Resumo da qualificação (Cat. No.: 41332(ES60)
- Fundo
Os dados resumidos neste relatório são realizados pela
A
- Materiais e métodos experimentais
2.1 CHO Kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras (3G), Fornecedor:
2.2 Kit de preparação de amostra de DNA residual magnético MolPure, fornecedor:
2.3 Dados originais: a versão eletrônica foi registrada no 'Relatório do Experimento' o subarquivo do arquivo pai CHO Kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras (3G).
2.4 Métodos: Os materiais e métodos de operação utilizados no experimento foram basicamente produzidos ou definidos pela
- Conteúdos e resultados da qualificação
3.1 Alcance de detecção
A faixa linear do kit foi de 3 fg/μL~300 pg/μL com R2=1, e a eficiência de amplificação foi de 99,09% com CV<15% para cada ensaio de concentração.
Figura 1 Curva padrão de qPCR de DNA CHO (3G)
3.2 Precisão
3.2.1 Rrecuperação
3.2.1.1 Experimento de recuperação de picos de amostra em branco
Amostras de CHO Padrões de DNA em altas e baixas concentrações: 30 pg/μL, 300 fg/μL e 3 fg/μL foram preparados, respectivamente, e analisados após a extração usando o Método de Esferas Magnéticas para o Kit de Pré-tratamento de Amostras Residuais de DNA (3 réplicas de extração foram realizadas para cada amostra, e 3 réplicas de ensaio foram feitas para cada extração), e as recuperações e CVs das amostras foram analisados.
Para diferentes concentrações de amostras de DNA, as recuperações variaram de 70% a 130%, e os CVs foram todos <20%.
| Tipo de amostra | Concentração Teórica | Extrair 1 média | Extrato 2 média | Extrair 3 média | Concentração média | cv | Recuperação |
| Amostra em branco | / | / | / |
| / | / | / |
| Amostra de recuperação 1 | 30 pg/μL | 27.07 | 27,51 | 28.27 | 27,62 | 2,20% | 92,06% |
| Amostra de recuperação 2 | 300 fg/μL | 285,53 | 301,25 | 295,71 | 294,16 | 2,71% | 98,05% |
| Amostra de recuperação 3 | 3 fg/μL | 3,50 | 3,54 | 3.31 | 3,45 | 3,56% | 115,00% |
Tabela 1 Recuperação de picos de amostra em branco
3.2.1.2 Experimento de simulação de recuperação de pico de amostra
Amostras da mesma concentração (300 fg/μL de DNA CHO) foram extraídas (3 réplicas de extração foram realizadas para cada amostra e 3 réplicas de ensaio foram feitas para cada extração) com 5 soluções de fundo diferentes (alta proteína, alto ácido nucleico, alto e baixo pH, alto sal) e as recuperações de amostra e CVs foram analisados.
As recuperações de amostras de DNA para diferentes soluções de fundo variaram de 70% a 130%, com todos os CVs <20%.
| Tipo de amostra | Concentração Teórica | Extrair 1 média | Extrato 2 média | Extrair 3 média | Concentração média | cv | Recuperação |
| Amostra básica | / | / | / |
| / | / | / |
| Alta Proteína | 300 fg/μL | 302,29 | 332,86 | 342,76 | 325,97 | 6,47% | 108,66% |
| Alto Ácido Nuclear | 284,47 | 290,66 | 308,76 | 294,63 | 4,28% | 98,21% | |
| Alto teor de sal | 272,96 | 286,25 | 312,91 | 290,71 | 7,00% | 96.90% | |
| pH alto | 296,04 | 320,58 | 324,56 | 313,72 | 4,92% | 104,57% | |
| pH baixo | 314,77 | 327,89 | 340,26 | 327,64 | 3,89% | 109,21% |
Tabela 2 Recuperação de picos de amostra básica
3.3 Precisão
3.3.1 Repetibilidade
Repita o ensaio 10 vezes para padrões de DNA CHO em uma concentração de 3 fg/μL com um CV <15%.
| Repetições | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | Significar | CV% |
| Valor de detecção (fg/μL) | 3.13 | 3.26 | 2,89 | 3.16 | 2,95 | 2,87 | 2,88 | 2,75 | 2,87 | 3.15 | 2,99 | 5,65% |
Tabela 3 Resultados de repetibilidade
3.3.2 Precisão intermediária
Três experimentadores testaram independentemente amostras padrão de DNA CHO em altas e baixas concentrações: 300 pg/μL, 3 pg/μL e 3 fg/μL, e três repetições foram feitas para cada concentração, e os CVs de todos os nove dados obtidos foram <15%.
| Exp |
Concentração real Concentração Teórica | ADN CHO (3G) | ||
| 300 pg/uL | 3 pg/uL | 3 fg/uL | ||
| Exp 1 | Determinação 1 | 302,63 | 2,97 | 3,40 |
| Determinação 2 | 294,54 | 3.01 | 3.14 | |
| Determinação 3 | 287,67 | 2,99 | 3.01 | |
| Exp2 | Determinação 4 | 292,27 | 2,92 | 3.47 |
| Determinação 5 | 299,61 | 2,90 | 2,82 | |
| Determinação 6 | 305,73 | 2,93 | 2,90 | |
| Exp 3 | Determinação 7 | 301.06 | 3.17 | 3.15 |
| Determinação 8 | 299,17 | 3,00 | 3.21 | |
| Determinação 9 | 290,66 | 2,90 | 3.05 | |
| / | Significar | 297,04 | 2,98 | 3.13 |
| / | CV% | 2.03 | 2,80 | 6,85 |
Tabela 4 Precisão intermediária Resultados
3.4 Especificidade
A interferência do DNA genômico celular comumente usado na produção de produtos biológicos foi avaliada quanto à interferência com reagentes de detecção de DNA CHO, e o grupo de interferência se sobrepôs ao grupo de controle e nenhuma interferência foi observada (a figura abaixo mostra, em ordem, os dados de interferência dos DNAs genômicos de Camundongo, MDCK, HEK293 e E. coli com reagentes de detecção de DNA CHO).
Figura 2 Resultados do experimento de interferência
3.5 Limite de Quantificação
O DNA CHO foi detectado em 3 fg/μL, 1 fg/μL, 0,5 fg/μL, 0,3fg/uL e 0,1 fg/μL, com 10 réplicas para cada concentração. Os resultados mostraram que o CV foi <20% em concentrações de 0,3 fg/μL e acima. Ou seja, o limite de quantificação do kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras CHO (3G) foi de 0,3 fg/μL.
|
Repetições Item de teste | DNA CHO (3G) (fg/μL) | |
| Quantidade | Taxa de Recálculo% | |
| 1 | 0,28 | 93,33% |
| 2 | 0,26 | 86,67% |
| 3 | 0,32 | 106,67% |
| 4 | 0,30 | 100,00% |
| 5 | 0,33 | 110,00% |
| 6 | 0,23 | 76,67% |
| 7 | 0,29 | 96,67% |
| 8 | 0,37 | 123,33% |
| 9 | 0,31 | 103.33% |
| 10 | 0,28 | 93,33% |
| Significar | 0,30 | / |
| CV% | 13,09% | / |
Figura 3. Resultado do teste qPCR de DNA CHO (3G)
3.6 Limite de detecção
O DNA CHO foi detectado em 0,3 fg/μL, 0,1 fg/μL, 0,05 fg/μL e 0,01 fg/μL, com 20 réplicas para cada concentração. Os resultados mostraram que a taxa de detecção foi ≥19 (ou seja, taxa de detecção ≥95%) em 20 poços replicados em concentrações de 0,05 fg/μL e acima. Ou seja, o limite de detecção do kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras CHO (3G) foi de 0,05 fg/μL.
Figura 4. Resultado do teste qPCR de DNA CHO (3G)
3.7 Robustez
Este kit foi testado e é adequado para, mas não limitado a, os seguintes instrumentos:
| Fornecedor | Modelos de Instrumentos | Eficiências de amplificação | R2 | Limite de quantificação | cv | Limite de detecção | Taxa de detecção |
| Termo | ABI 7500 | 99,69% | 1 | 0,3 fg/μL | 12,40% | 0,05 fg/μL | 95,65% |
| Termo | ABI QuantStudio5 | 99,26% | 1 | 0,3 fg/μL | 15,30% | 0,05 fg/μL | 100,00% |
| Rocha | Ciclo de Luz480 | 2,05% | 0,978 | 0,3 fg/μL | / | 0,05 fg/μL | / |
| Xangai Hongshi | SLAN | 101,14% | 0,999 | 0,3 fg/μL | 14,41% | 0,05 fg/μL | 95,65% |
Tabela 5 Resultados dos testes de adequação do instrumento
3.8 Estabilidade
3.8.1 Estabilidade de congelamento e descongelamento
O kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras CHO (3G) foi testado por congelamento e descongelamento repetidos 10 vezes, e o desempenho do kit não foi afetado.
|
Indicadores de teste Tempos de congelamento e descongelamento | Parâmetro | Tempo T0 | Congelar e descongelar 10 vezes |
| Parâmetro de curva padrão | Eficiências de amplificação | 95,70% | 98,62% |
| R2 | 1 | 1 | |
| Limite de quantificação (0,3 fg/μL) | cv | 15,31% | 17,16% |
| Limite de detecção (0,05 fg/μL) | Taxa de detecção | 95,65% | 100% |
Tabela 6 Análise dos resultados da estabilidade de congelamento e descongelamento
3.7.2 Estabilidade Acelerada
O kit de detecção de resíduos de DNA de células hospedeiras CHO (3G) foi armazenado a 2~8°C por 30 dias e 37°C por 14 dias, respectivamente. Nenhum desempenho do kit foi afetado.
|
Indicadores de teste Temperatura e tempo de aceleração | Parâmetro | Experimento 1 | Experimento 2 | ||
| Tempo T0 | 2~8℃ 30 Dias | Tempo T0 | 37℃ 14 dias | ||
| Parâmetro de curva padrão | Eficiências de amplificação | 100,53% | 102,61% | 101,76% | 101,84% |
| R2 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Limite de quantificação (0,3 fg/μL) | cv | 17,16% | 12,63% | 16,27% | 12h49 |
| Limite de detecção (0,05 fg/μL) | Taxa de detecção | 95,65% | 100% | 95,57% | 100% |
Tabela 7 Análise dos resultados da estabilidade acelerada
3.9 Limite de Espaço em Branco
3.9.1 Nenhum controle de modelo (NTC)
Nenhum controle de modelo (NTC) foi a diluição de DNA com 96 repetições para fazer o ensaio quantitativo de qPCR, todos os valores de CT acima dos 96 poços replicados testados foram >40.
Figura 5 Resultados do experimento NTC
3.9.2 Amostra de controle de extração negativa (NCS)
A Amostra de Controle de Extração Negativa (NCS) foi a diluição do DNA, e foi primeiramente extraída pelo pré-tratamento da amostra, então foi feito qPCR, todos os valores de CT acima dos 48 poços replicados testados foram >40.
Figura 6 NCS resultados do experimento
- 4.Referência
4.1 Comissão da Farmacopeia Chinesa (ChPC). Farmacopeia da República Popular da China (Vol Ⅲ) [S]. Pequim: China Medical Science and Technology Press, p.542-543, 2020.
4.2 NMPA, 2007: Princípios Gerais para Revisão Técnica de Validação de Métodos Analíticos para Controle de Qualidade de Produtos Biológicos.
4.3 ICH(2022)《Validação de método analítico Q2》, versão de rascunho.
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