A tecnologia de amplificação isotérmica pode atingir o propósito de amplificar sequências específicas de ácido nucleico sob condições de temperatura constante. Devido às características de nenhum equipamento especial, tempo de amplificação curto e alta sensibilidade, ela mostrou boas perspectivas de aplicação em detecção no local e diagnóstico no ponto de atendimento e é muito adequada para o desenvolvimento de ferramentas de diagnóstico molecular.

No contexto da pandemia do novo coronavírus com aumento de cepas e infectividade, a tecnologia de amplificação isotérmica pode detectar o novo coronavírus rapidamente com instrumentos simples, ajudando a resolver o problema de que alguns pacientes com COVID-19 não podem ser confirmados rapidamente devido ao longo tempo de detecção e aos altos requisitos de equipamentos de detecção e reagentes das técnicas tradicionais de PCR. Então, qual é o princípio do RT-LAMP, uma das técnicas de amplificação isotérmica? Quais são as matérias-primas de alta qualidade que a Yeasen pode fornecer?

1. Qual é o princípio do RT-LAMP?
2. Projeto de primer para RT-LAMP
3. Quais matérias-primas a Yeasen pode fornecer?
4. Guia de seleção de produtos

1. Qual é o princípio do RT-LAMP?

Em 2000, os acadêmicos japoneses Notomi e outros estabeleceram uma nova tecnologia de amplificação de ácido nucleico chamada amplificação isotérmica mediada por loop (LAMP). O LAMP usa 4 primers específicos projetados para 6 regiões do gene alvo e usa DNA polimerase de deslocamento de fita para amplificar 109 cópias da sequência alvo em dezenas de minutos sob condições isotérmicas (60～65 ℃). Os resultados foram julgados por eletroforese em gel de agarose, e os resultados positivos mostraram bandas em forma de escada. O LAMP tem as características de forte especificidade, alta sensibilidade, operação rápida e simples e baixo custo. Com a melhoria contínua e o aperfeiçoamento desta tecnologia, ela é atualmente usada na detecção de vários microrganismos patogênicos.

RT-LAMP é um método no qual a transcriptase reversa é adicionada ao sistema de amplificação LAMP, que pode realizar a detecção direta do RNA viral. A eficiência de amplificação do LAMP é extremamente alta, então uma grande quantidade de ácido nucleico pode ser amplificada com apenas uma pequena quantidade de cDNA. O tempo de transcrição reversa no processo de amplificação do ácido nucleico é economizado, e a velocidade de detecção do RNA é acelerada.

O DNA está em um estado de equilíbrio dinâmico a cerca de 65℃. Sob a ação da DNA polimerase de deslocamento de fita, começando na extremidade 3' do segmento F2 do primer FIP, ele é pareado com a sequência complementar do DNA molde para iniciar a síntese de DNA de deslocamento de fita. O primer F3 é complementar ao F3c na extremidade frontal do F2c e toma a extremidade 3' como ponto de partida para sintetizar seu DNA enquanto substitui a fita de DNA sintetizada pelo primer FIP líder pela ação de uma DNA polimerase de deslocamento de fita. Estenda para frente. A fita de DNA sintetizada pelo primer F3 final forma uma fita dupla com uma fita de DNA molde. A fita de DNA sintetizada pelo primer FIP é substituída pela fita do primer F3 para gerar uma fita simples. Esta fita simples tem segmentos F1c e F1 complementares na extremidade 5', então o pareamento de autobase é realizado para formar uma estrutura circular. E o primer BIP é hibridizado e combinado com a fita simples, e a extremidade 3' do primer BIP é usada como ponto de partida para sintetizar uma fita complementar, e a estrutura é aberta no processo.Então, primers similares a F3 e B3 são inseridos do primer BIP, o pareamento complementar de bases é realizado, e uma nova fita complementar é sintetizada a partir da extremidade 3' como ponto de partida. Há sequências complementares em ambas as extremidades do DNA fita simples substituído, e o pareamento de autobases ocorre para formar uma estrutura circular, então toda a cadeia apresenta uma estrutura tipo haltere. Essa estrutura é a estrutura inicial do ciclo de amplificação do método RT-LAMP.

Na estrutura em forma de haltere, a extensão do DNA é realizada usando o segmento F1 na extremidade 3' como ponto de partida e usando a si mesmo como molde. E o primer FIP F2 hibridiza com o F2c de fita simples no loop para iniciar uma nova rodada de reação de deslocamento de fita. O ácido nucleico de fita dupla sintetizado a partir do segmento F1 é dissociado e, de forma semelhante, uma estrutura circular é formada no ácido nucleico. Há uma forma de fita simples de B2c na estrutura circular, e B2 no primer BIP hibridiza com ele para iniciar uma nova rodada de amplificação, e uma estrutura circular é formada através do mesmo processo. De acordo com esse processo, sequências complementares na mesma fita ciclam por meio de pareamento, extensão de fita e, finalmente, formam estruturas de tamanhos diferentes.

2. Projeto de primer para RT-LAMP

O design do primer é a chave para a amplificação e detecção bem-sucedidas do RT-LAMP. Os primers RT-LAMP incluem dois primers externos (F3 e B3) e dois primers internos (FIP e BIP). Primer F3: O primer externo a montante, consistindo da região F3, é complementar à região F3c do gene alvo. Primer FIP: primer interno a montante, consistindo da região F2, a região F2c na extremidade 3' do gene alvo na região F2 é complementar à região F1c na extremidade 5' do gene alvo. Primer BIP: primer interno a jusante, composto da região B2, a região B2 é complementar à região B2c na extremidade 3' do gene alvo e tem a mesma sequência que a região B1c na extremidade 5' do gene alvo.

Semelhante à PCR, os princípios de design de primer devem prestar atenção a fatores como composição de base, conteúdo de GC e subestrutura. Além disso, os seguintes pontos devem ser observados. As porções de extremidade 5' dos primers internos FIP e BIP, ou seja, F1c e B1c, têm geralmente 8-50 pb de comprimento. O comprimento é preferencialmente de 15 a 25 pb, e o valor de Tm é maior do que os valores de Tm de F2 e B2 na porção de extremidade 3'. As porções de extremidade 3' dos primers internos FIP e BIP, ou seja, F2 e B2, têm geralmente 8-50 pb de comprimento. O comprimento é preferencialmente de 15-25 pb, e o valor de Tm é consistente com a temperatura ótima da Bst DNA polimerase selecionada no experimento. Os comprimentos dos primers externos F3 e B3 são geralmente 8-50 pb. O comprimento é preferencialmente de 15-25 pb, e seu valor de Tm é menor do que o de F2 e B2. Ao projetar primers, a estrutura do loop e o tamanho da sequência alvo devem ser considerados. Quando o número de bases no loop é maior que 40bp e o tamanho da sequência alvo é 130-200bp, a eficiência de amplificação é a mais alta.

3. Quais matérias-primas a Yeasen pode fornecer?

3.1 [Nova atualização] Yeasen Bst Mais DNA Polimerase

O recém-atualizado Hieff™ Bst Plus DNA Polimerase (Cat#14402ES, 14403ES) é obtido pela expressão e purificação do gene da DNA polimerase do Bacillus stearothermophilus sp sem o domínio de exonuclease 5′→3′ em E. coli.A capacidade de deslocamento da fita enzimática é forte e tem as vantagens de alta sensibilidade, alta eficiência de amplificação e alta tolerância a dUTP, e pode ser amplamente utilizada na detecção de patógenos em tempo real com base na tecnologia de amplificação isotérmica.

3.1.1 Rápido e alta sensibilidade

Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase tem alta sensibilidade e pode detectar o gene alvo em apenas 5 cópias. A quantidade de modelo está no nível do femtograma (fg), e a taxa de amplificação é mais rápida do que a dos produtos concorrentes.

Figura 1. A reação RT-LAMP foi realizada com Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase (Laranja) e enzimas Bst do concorrente N (Cinza) e concorrente T (Azul) para amplificar o SARS-CoV-2. Os resultados mostram que a Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA Polymerase pode sempre atingir o limite mais rápido do que os produtos concorrentes, e a taxa de amplificação é mais rápida.

4. Guia de seleção de produtos

Os produtos fornecidos pela Yeasen são os seguintes:

Tabela 1.Informações do produto