O anticorpo anti-TAQ DNA polimerase de duplo bloco para ajudar a reduzir a amplificação inespecífica

O diagnóstico molecular é o subcampo de desenvolvimento mais rápido no campo do IVD. Ele tem as vantagens de tempo de detecção curto, alta sensibilidade e forte especificidade. É amplamente utilizado no diagnóstico concomitante de tumores e triagem de doenças infecciosas e doenças genéticas. No campo do diagnóstico molecular, a PCR não é apenas a plataforma de tecnologia mais madura com a maior participação de mercado, mas também a tecnologia "padrão ouro" do diagnóstico clínico. Na reação de PCR tradicional, o problema da amplificação não específica ocorre frequentemente. A amplificação não específica afeta diretamente a interpretação dos resultados de detecção e levará ao declínio da sensibilidade da amplificação e até mesmo ao rendimento dos fragmentos alvo. Como ocorre a amplificação não específica e como ela pode ser efetivamente evitada?

1. A DNA polimerase convencional pode levar à amplificação não específica

2. A polimerase de partida a quente pode melhorar a especificidade da amplificação

3. O anticorpo Taq de bloqueio duplo pode melhorar duplamente a especificidade e a estabilidade da amplificação

4. Exibição de desempenho do Taq de bloco duplo de Yeasen anticorpo

5. Informações do produto

1. A DNA polimerase convencional pode levar à amplificação não específica

A baixa especificidade de sequência dos primers é a causa direta da amplificação não específica. Como promotor da DNA polimerase convencional, sua atividade de exonuclease pode truncar a sequência do primer de DNA durante a preparação do sistema de PCR, para reduzir a especificidade dos primers.

Além disso, a DNA polimerase convencional não só tem atividade de exonuclease, mas também tem atividade de polimerase. Embora a temperatura de extensão ideal da DNA polimerase seja 72℃, a polimerase ainda está ativa à temperatura ambiente. Portanto, durante a preparação da reação de PCR e o processo de aquecimento inicial, os primers podem formar ligações não específicas com alguns moldes de fita simples e se estender sob a ação da Taq DNA polimerase, resultando na amplificação de sequências não alvo e afetando a especificidade da reação.

Portanto, os sistemas de PCR são frequentemente configurados no gelo para inibir a atividade da DNA polimerase. Embora esse método seja simples e barato, ele não pode inibir completamente a atividade da enzima, portanto, não pode eliminar a amplificação de produtos não específicos.

2. A polimerase de partida a quente pode melhorar a especificidade da amplificação

A polimerase de partida a quente é o componente principal da PCR de partida a quente. À temperatura ambiente, o sítio ativo da DNA polimerase é bloqueado por um modificador enzimático. Somente após a desnaturação da PCR a 95℃, o modificador enzimático cai e a atividade enzimática é iniciada, evitando a amplificação não específica causada pela enzima.

Atualmente, os métodos de modificação de partida a quente comumente usados ​​da DNA polimerase no mercado incluem principalmente um método químico, método de ligante e método de anticorpo. Entre eles, o efeito de bloqueio da polimerase de partida a quente modificada por anticorpo é o melhor, e a velocidade de liberação da atividade enzimática é rápida, o que pode reduzir muito o tempo de reação da PCR. É um método de modificação enzimática de partida a quente amplamente usado no mercado de IVD.

Entretanto, deve-se observar que o método tradicional de inicialização a quente do anticorpo bloqueia apenas a atividade da polimerase 5'→3' da Taq DNA polimerase, o que só pode evitar a amplificação não específica causada por incompatibilidade ou dímero de primer em baixas temperaturas.No entanto, como mencionado acima, a Taq DNA polimerase não só tem atividade de polimerase 5'→3', mas também tem atividade de exonuclease 5'→ 3'. Essa atividade de exonuclease pode levar à degradação de sondas incompatíveis ou outros materiais em baixas temperaturas, resultando em alguns sinais não específicos.

3. O anticorpo Taq de bloqueio duplo pode melhorar duplamente a especificidade e a estabilidade da amplificação

Como líder inovadora na indústria doméstica de enzimas moleculares, a Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (doravante denominada Yeasen) se concentra em P&D e produção de matérias-primas de enzimas moleculares e ousa inovar. Confiando em sua própria plataforma de triagem de anticorpos maduros, ela rastreia o anticorpo bloqueador com a Taq DNA polimerase como molécula alvo. Após anos de pesquisa meticulosa e otimização do sistema, ela desenvolveu o anticorpo anti-Taq DNA polimerase de bloco duplo, Ele não só pode bloquear a atividade da polimerase da Taq DNA polimerase, mas também bloquear a atividade da exonuclease da Taq DNA polimerase. Em uma abordagem dupla, ele não só pode efetivamente prevenir a amplificação não específica causada por incompatibilidade ou dímero de primer, mas também evitar que a degradação do material gere sinais não específicos e melhorar duplamente a estabilidade do reagente.

4. Exibição de desempenho do Taq de bloco duplo de Yeasen anticorpo

4.1 O uso do anticorpo Taq de bloco duplo é preciso e mais sensível

Após bloquear a Taq polimerase com o anticorpo de duplo bloqueio de Yeasen e anticorpo da empresa T, as amostras positivas foram detectadas por ARMS-PCR.

Figura 1. Curva de amplificação ARMS-PCR; Azul: anticorpo bloqueador da empresa T; Vermelho: anticorpo de duplo bloqueio de Yeasen

Pode-se observar na Figura 1 que a Taq polimerase bloqueada pelo anticorpo de duplo bloqueio de Yeasen apresenta tipagem precisa e maior sensibilidade na amplificação por ARMS-PCR.

4.2 O anticorpo Taq de duplo bloco efetivamente Bloqueou a atividade exonuclease da Taq DNA polimerase

As sondas de primer sintetizadas foram combinadas com a solução de reação da Taq DNA polimerase bloqueada por anticorpos não fechados e duplamente bloqueados, respectivamente, e reagiram a 40℃ para detectar seus sinais de fluorescência.

Figura 2. Detecção da eficiência de bloqueio do anticorpo de bloqueio duplo para atividade de exonuclease; Amarelo: grupo Taq DNA polimerase não fechado; Roxo: grupo Taq DNA polimerase bloqueado por anticorpo de bloqueio duplo

Pode ser visto na Figura 2 que o anticorpo de bloqueio duplo pode bloquear efetivamente a atividade de exonuclease da Taq DNA polimerase.

4.3 O anticorpo Taq de bloco duplo pode melhorar efetivamente a estabilidade do reagente de detecção

A Taq DNA polimerase foi bloqueada com anticorpo de bloqueio tradicional e anticorpo de bloqueio duplo, respectivamente, e configurada em uma pré-mistura completa contendo sonda de primer. 10.000 cópias do plasmídeo ASF foram amplificadas a 4℃ por 10 dias ou a 37℃ por 1, 3 e 5 dias. A curva de amplificação e as mudanças no valor de Ct foram observadas, e os efeitos do anticorpo de bloqueio tradicional e do anticorpo de bloqueio duplo na estabilidade da solução de reação da pré-mistura completa foram comparados.

Figura 3.Curva de amplificação de 10.000 cópias do plasmídeo ASF amplificado por anticorpo de bloqueio tradicional (a) e anticorpo de bloqueio duplo (b) solução de reação de bloqueio; Azul: armazenar a 4℃ por 10 dias; Vermelho: colocado a 4℃ por 0 dias (controle)

Pode ser visto na Figura 3 que o anticorpo de bloqueio duplo pode manter a estabilidade da solução de reação e efetivamente melhorar a estabilidade do reagente de detecção do que o anticorpo de bloqueio tradicional. A curva de amplificação e o valor de Ct não mudaram significativamente após toda a pré-mistura contendo a sonda de primer ter sido bloqueada por um anticorpo de bloqueio duplo e colocada a 4℃ por 10 dias.

Figura 4. Curva de amplificação de 10.000 cópias do plasmídeo ASF amplificado por anticorpo de bloqueio tradicional (a) e solução de reação de bloqueio de anticorpo de bloqueio duplo (b); Azul: armazenar a 37℃ por 5 dias; Verde: 37℃ por 3 dias; Amarelo: 37℃ por 1 dia; Vermelho: colocado a 37℃ por 0 dias (controle)

Pode ser visto na Figura 4 que o anticorpo de bloqueio duplo pode manter a estabilidade da solução de reação e efetivamente melhorar a estabilidade do reagente de detecção do que o anticorpo de bloqueio tradicional. O anticorpo de bloqueio duplo bloqueia toda a pré-mistura contendo o primer-sonda, e a diferença do valor Ct é menor que 0,2 após ser colocado a 37℃ por 1, 3 e 5 dias.

4.4 O anticorpo Taq de bloqueio duplo ajuda a resolver o problema do desvio da linha de base

Quando alguns primers cooperam com um tampão e instrumentos específicos, haverá desvio da linha de base. Yeasen tentou muitos métodos para melhorar o problema da linha de base e descobriu que o anticorpo de bloqueio duplo era mais propício para uma linha de base estável.

Figura 5. Curva de amplificação do gene N (a) e do gene ACT (b); Vermelho: anticorpo bloqueador tradicional; Verde: anticorpo de bloqueio duplo

Como pode ser visto na Figura 5, o uso de anticorpos de bloqueio duplo sob primers e tampões específicos pode ajudar a resolver o problema de desvio da linha de base.

4.5 Boa linearidade foi obtida usando anticorpo Taq de bloco duplo

100000, 10000, 1000 e 100 cópias de plasmídeos duplos ASF/ACT foram amplificadas com a solução de reação bloqueada por um anticorpo de bloqueio duplo, e a curva padrão foi feita.

Figura 6. Curvas padrão do gene ASF (a) e do gene ACT (b) produzidos pela solução de reação de duplo bloco

Como pode ser visto na Figura 6, a curva padrão R2 do gene ASF é 0,998, e a eficiência de amplificação é 98,848%; A curva padrão R2 do gene ACT foi de 0,998 e a eficiência de amplificação foi de 98,113%.

4.6 Taq de bloco duplo O anticorpo pode liberar rapidamente a atividade enzimática

A polimerase Taq foi bloqueada com anticorpo importado da empresa T e Anticorpo de duplo bloqueio de Yeasen (cat#31303) respectivamente, e a atividade enzimática foi detectada após choque térmico a 95 ℃ por 20 s. Pode-se observar que 31303 pode liberar mais de 95% da atividade enzimática após choque térmico a 95 ℃ por 20 s, o que é equivalente ao anticorpo da empresa T.

Tabela 1. Atividade enzimática

4.7 Taq de bloco duplo Anticorpo Pode bloquear muitos tipos de enzimas Taq

Três tipos de enzimas Taq (tipo selvagem e 2 mutantes) foram bloqueados pelo anticorpo de bloqueio duplo de Yeasen (cat#31303), e a razão de bloqueio foi de 1 μ g: 5 U, medindo o valor de fluorescência e a eficiência de vedação. Pode ser visto que o efeito de bloqueio do anticorpo de bloqueio duplo de Yeasen (cat#31303) é melhor para diferentes tipos de enzimas Taq.

Tabela 2. Eficiência de bloqueio de diferentes tipos de enzimas Taq

4.8 Yeasen O anticorpo Taq de bloco duplo não tinha resíduo genômico em camundongos

Tomando água como molde para o controle negativo e genoma de camundongo como molde para o controle positivo, 31303 lotes diferentes foram amplificados. Foi descoberto que o fragmento alvo não foi amplificado na amostra, indicando que não havia resíduo de genoma de camundongo no anticorpo.

Figura 7. Diagrama de detecção de resíduos do genoma do camundongo

Nota: - é o controle negativo, + é um controle positivo e 1-5 são 31303 amostras de lotes diferentes

5. Informações do produto