Contaminação por aerossol no ambiente operacional como a causa mais comum de falsos positivos em resultados de PCR: a descoberta pioneira da uracila DNA glicosilase (UDG) pela cientista americana Lindahl em E. coli e Bacillus subtilis, e o estabelecimento de um sistema de prevenção de contaminação por PCR por meio do uso da enzima UDG com dUTP.
As enzimas UDG disponíveis comercialmente consistem principalmente em dois tipos: as enzimas UDG regulares derivadas de Escherichia coli e Bacillus subtilis, e as enzimas UDG termolábeis provenientes de bactérias marinhas psicrofílicas. As enzimas UDG regulares exibem maior resistência ao calor, retendo uma pequena quantidade de atividade de uracil-DNA glicosilase mesmo após tratamento a 95 °C por 10 minutos, o que pode levar à degradação de produtos de amplificação alvo contendo dU. Além disso, devido ao uso de cepas bacterianas projetadas (como E. coli) para a expressão recombinante de enzimas moleculares, há uma certa quantidade de DNA genômico residual do hospedeiro nessas enzimas. Juntamente com as influências do ambiente de fabricação e fontes humanas, os produtos de enzimas moleculares são altamente suscetíveis à contaminação por DNA. Durante a detecção de patógenos, o DNA contaminante pode mascarar ácidos nucleicos alvo de baixa abundância ou ser detectado junto com eles, afetando assim a interpretação dos resultados.
Yeasen UCF.ME Uracil DNA Glicosilase (UDG/UNG), termolábil
Descrição
UCF.ME Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), termolábil, 1 U/μL (Cat#14466ES) derivada de bactérias marinhas psicrofílicas, é uma enzima UDG termolábil residual ultrabaixa conhecida como UCF.ME. O uso deste produto pode evitar que a atividade residual de enzimas UDG convencionais após a inativação degrade produtos de amplificação contendo dU em temperatura ambiente. Também evita que bactérias de fundo presentes em enzimas moleculares causem falsos positivos em resultados de PCR. Portanto, a introdução da enzima UDG termolábil residual ultrabaixa UCF.ME® é crucial para identificar com precisão patógenos infecciosos e auxiliar no diagnóstico clínico de infecções e doenças infecciosas.
Vantagens do produto
- Resíduo ultrabaixo de UCF.ME—resíduo de DNA genômico de E. coli <0,1 cópias/ U;
- Baixo resíduo de nuclease — Nenhuma exonuclease residual, enzima de corte ou RNase;
- Forte capacidade de digestão — 0,05 U/T pode digerir 105 cópias/T de produtos dU-DNA;
- Boa termolabilidade — Inativação completa sob qualquer condição de 50°C por 10 minutos, 55°C por 5 minutos ou 95°C por 5 minutos;
- Compatível com sistemas de reação RT-qPCR — Sem impacto no sistema de detecção, mesmo em altos níveis de entrada (sistema de reação 2U/20μL).
（1）Pureza da proteína≥95%
Figura 1. Resultados da detecção de pureza de proteína (SDS-PAGE)
（2）Nucleases residuais baixas: sem exonucleases residuais, enzimas de corte ou RNases
Figura 2. Resultados do teste de resíduos de nuclease
（3）Resíduo de DNA genômico de E. coli < 0,1 cópias/ U, os níveis de resíduos foram significativamente menores do que o reagente convencional
Figura 3. Resultados do teste de resíduos de DNA genômico de E. coli
Figura 4. Um total de 0,05 U da enzima UDG poderia digerir completamente 10^5 cópias/T de produtos dU-DNA.
Figura 5. Após tratamento de inativação por calor de 50℃, 10min; 55℃, 5min; 55℃, 10min; 95℃, 5min, o 14466ES perdeu a capacidade digestiva.
Figura 6. A mistura RT-qPCR foi preparada usando duas sondas de priming dos genes ORF1ab e N e 14466ES. Quando 14466ES foi injetado no sistema de reação na quantidade de 2U/20μL, não houve inibição de RT-qPCR reação.
Recomendação de produto — Série de matérias-primas enzimáticas de PCR com resíduo ultrabaixo
| Posicionamento do produto | Nome do produto | Gato |
| UDG lábil ao calor para prevenção de contaminação | UCF.ME Uracil DNA Glicosilase (UDG/UNG), lábil ao calor, 1 U/μL | 14466ES |
| Taq DNA polimerase de partida a quente | Hieff UCF.ME Hotstart Taq DNA Polimerase Sensível (5 U/μL) | 14314ES |
| Transcriptase reversa | Hifair UCF.ME V Transcriptase Reversa (200 U/μL) | 14608ES |
| Inibidor de RNase murina | 14672ES |