dNTP significa trifosfato de ribonucleotídeo padronizado usado em PCR, capaz de amplificar uma fita de DNA em crescimento. Em outras palavras, dNTPs em PCR se alojam com fitas de DNA complementares por meio de ligações de hidrogênio, e as fitas de DNA em crescimento são expandidas com a ajuda da Taq DNA polymerase. Qual é a aplicação específica de dNTP em PCR? Quais são as propriedades que dNTPs de alta pureza precisam ter?

1. O que são dNTPs?
2. Qual é a concentração de dNTP na PCR?
3. Quais são as propriedades necessárias do dNTP de alta pureza?
4. Produtos relacionados e desempenho

1. O que são dNTPs?

Trifosfatos de desoxinucleosídeos (dNTPs) são trifosfatos de nucleosídeos contendo desoxirribose, uma cadeia de nucleotídeos consistindo de ribose, uma base e um fosfato. Os dNTPs são os blocos de construção essenciais das moléculas de ácido nucleico e, como tal, são componentes necessários das misturas de PCR, pois nenhum novo DNA amplificado poderia ser gerado sem eles. Os quatro desoxinucleotídeos individuais que compõem uma sequência de DNA incluem trifosfato de desoxiadenosina (dATP), trifosfato de desoxitimidina (dTTP), trifosfato de desoxicitidina (dCTP) e trifosfato de desoxiguanosina (dGTP). Além disso, a qualidade dos dNTPs também é crítica para o sucesso de muitos procedimentos, como PCR, síntese de cDNA, qPCR, sequenciamento, clonagem e marcação de DNA.

Existem quatro tipos de dNTP, ou desoxinucleotídeo trifosfato, com cada um usando uma base de DNA diferente: adenina (dATP), citosina (dCTP), guanina (dGTP) e timina (dTTP). Usar dNTP durante a fase de extensão fornece bases simples prontas para entrar no DNA e duplicá-lo, como blocos de construção. Como o propósito da técnica é sintetizar novo DNA, o dNTP fornece nucleotídeos para a fita “descompactada” usando o molde de um único lado. Isso transforma uma fita única de DNA em duas, e pode continuar exponencialmente enquanto os reagentes permanecerem presentes até o estágio final de espera.

2. Qual é a concentração de dNTP na PCR?

PCR é uma técnica in vitro de síntese de DNA que é realizada para gerar múltiplas cópias de um fragmento de DNA de interesse para que ele possa ser visualizado sob eletroforese em gel. O propósito da PCR é fazer um grande número de cópias de DNA para várias aplicações downstream em sequenciamento de DNA ou microarrays de DNA. Seus componentes incluem moldes de DNA, primers, tampões e Taq DNA polimerase dNTP. Para entender o mecanismo da PCR, é necessário entender a importância e o princípio dos componentes usados. dNTP é um dos principais componentes da PCR. A função dos dNTPs na PCR é amplificar a fita de DNA em crescimento com a ajuda da Taq DNA polimerase e combinar com a fita de DNA complementar por meio de ligação de hidrogênio.

O processo de PCR é dividido em três etapas dependentes da temperatura: desnaturação, anelamento e extensão. Durante a etapa de desnaturação, o DNA fita dupla é desnaturado para DNA fita simples. Durante a etapa de anelamento, os primers se ligam no local exato de sua sequência complementar e, durante a etapa de extensão, a Taq DNA polimerase adiciona dNTPs à fita de DNA em crescimento. Uma vez que as fitas são abertas e os primers se ligam ao DNA fita simples, a Taq DNA polimerase inicia sua atividade catalítica. Na próxima etapa, a adição de dNTPs começa, que se liga ao complexo P-DNA com menos afinidade se o nucleotídeo complementar exato estiver presente. Logo após a Taq DNA polimerase se manter, ocorrem interações de ligação de hidrogênio entre bases complementares e dNTPs. Aqui, não é o nucleotídeo inteiro no início, mas a base (base de nitrogênio) no dNTP que decide se deve se ligar ou não.Primeiro, se encontrar uma base complementar (A para T, G para C) no ssDNA modelo, formará uma ligação de hidrogênio entre elas. Três ligações de hidrogênio entre C e G e duas ligações de hidrogênio entre A e T são feitas. Uma vez que a ligação de hidrogênio é formada, a Taq DNA polimerase cumpre com a incorporação do dNTP na fita de DNA em crescimento, formando uma ligação fosfodiéster. Agora, depois que a ligação fosfodiéster é formada, a Taq DNA polimerase vai um passo além na adição de novos dNTPs. Uma ligação fosfodiéster é formada entre o 3'OH do primer e o 5'P do dNTP. Após a ligação de hidrogênio, a Taq DNA polimerase catalisa a reação removendo gama e beta-fosfatos dos trifosfatos de dNTPs. Após a reação ser concluída, dois pirofosfatos (PPi) são liberados. Mas a cinética exata da interação dos dNTPs e da Taq polimerase em reações de PCR permanece desconhecida.

Esses quatro nucleotídeos são normalmente adicionados à reação de PCR em quantidades equimolares para incorporação ótima de bases. No entanto, em certas situações, como mutagênese aleatória por PCR, concentrações desbalanceadas de dNTP são intencionalmente fornecidas para promover um grau maior de incorporação incorreta por uma DNA polimerase não revisora. O fator que determina a concentração mínima de dNTP é o comprimento do DNA e a composição da sequência alvo. Na reação de PCR, o dNTP é geralmente 50-200 μmol/L. Quando a concentração final de dNTP é maior que 50 mmol/L, ela pode inibir a atividade da Taq DNA polimerase. As concentrações dos quatro dNTPs devem ser iguais para reduzir a incorporação incorreta durante a amplificação devido à falta de um dNTP.

Em aplicações comuns de PCR, a concentração final recomendada de cada dNTP é geralmente 0,2 mM. Concentrações mais altas podem ser úteis em alguns casos, especialmente na presença de altas concentrações de Mg²⁺, como Mg²⁺ liga-se aos dNTPs e reduz sua taxa de incorporação, aumentando a taxa não específica. O dNTP contém fosfato, que pode se combinar com Mg²⁺ para reduzir a concentração de Mg livre²⁺, então a mudança em sua concentração afetará a concentração efetiva de Mg²⁺. Sob condições de alta concentração de DNA e dNTP, o Mg²⁺ a concentração deve ser ajustada de acordo. Além disso, a escassez de dNTPs leva a produtos de PCR incompletos. No entanto, dNTPs que excedem concentrações ótimas podem inibir a PCR. Para incorporação eficiente pela DNA polimerase, dNTPs livres devem estar presentes na reação em uma concentração não inferior a 0,01-0,015 mM.

3. Quais são as propriedades necessárias do dNTP de alta pureza?

Desde sua descoberta, a reação em cadeia da polimerase é a ferramenta inigualável usada na pesquisa genética molecular. O dNTP é empregado em PCR para expandir a fita de DNA em crescimento. Mesmo que a qualidade do dNTP no sistema seja ruim, isso terá um impacto negativo nas propriedades do produto final. O dNTP de alta pureza da Yeasen é adequado para todos os tipos de aplicações de síntese de DNA altamente sensíveis e reprodutíveis.

A Yeasen oferece nucleotídeos, conjuntos e misturas de grau GMP prontos para uso, fornecidos como sais de sódio em água purificada a pH 7,0. O processo de fabricação elimina impurezas e inibidores específicos de PCR, e os dNTPs são especialmente fabricados para aplicações de biologia molecular. Os dNTPs são purificados com HPLC preparativa e possuem pelo menos 99% de pureza. Eles podem ser usados ​​em processos de PCR, RT-qPCR, LAMP, marcação de DNA e sequenciamento de DNA.
Padrões de controle rigorosos e tecnologia de ponta garantem a melhor qualidade do produto. Cada lote de dNTP é testado para vários resíduos (DNA bacteriano, DNA humano, DNase, RNase, Endonuclease).O produto é estável de lote para lote e adequado para todos os tipos de aplicações de síntese de DNA altamente sensíveis e reprodutíveis.

4. Produtos relacionados e desempenho

4.1 Nenhum resíduo de DNA bacteriano

Figura 1. Os resultados da detecção mostram que os dNTPs não possuem resíduos do genoma bacteriano.

4.2 Nenhum resíduo de DNA humano

Figura 2. Os resultados da detecção mostram que os dNTPs não possuem resíduos do genoma humano.

4.3 Sem contaminação por DNase, RNase e Endonuclease

Figura 3. Os resultados da detecção mostram que os dNTPs não possuem DNase, RNase e Endonuclease.

4.4 Amplificação por PCR (DNA de 20 kb)

Figura 4. O resultado da amplificação por PCR é o produto esperado de 20 kb.

4.5 Informações sobre produtos

Os produtos fornecidos pela Yeasen são os seguintes.

Tabela 1.Informações sobre produtos