Desde março de 2022, a astuta cepa mutante Ômicron mais uma vez quebrou a vida pacífica das pessoas, as novas epidemias de coronavírus eclodiram por todo o país e afetaram 30 províncias (regiões autônomas e municípios). Como um meio eficaz de prevenção e controle precisos da epidemia de SARS-CoV-2, a detecção de ácido nucleico se tornou um modo de vida normal. "Você fez o teste de ácido nucleico hoje?" Também se tornou uma saudação diária das pessoas. Falando nisso, você sabe quais são as principais matérias-primas necessárias na detecção de ácido nucleico? Este artigo apresentará a principal matéria-prima crítica na enzima de detecção de ácido nucleico.

1. Processo de detecção de ácido nucleico para SARS-CoV-2

2. Enzimas essenciais na extração de ácido nucleico

3. Enzimas centrais durante RT-qPCR

4. Enzimas essenciais da detecção de ácido nucleico do SARS-CoV-2 a partir de Yeasen

1. Processo de detecção de ácido nucleico para SARS-CoV-2

Uma enzima é uma classe extremamente importante de biocatalisadores com alta eficiência catalítica e especificidade de reação. A maioria das reações bioquímicas requer a participação de enzimas. No processo de detecção de ácido nucleico de 2019-nCoV (mostrado na Figura 1), diferentes tipos de enzimas moleculares desempenham um papel importante em diferentes estágios experimentais, como extração de ácido nucleico e RT-qPCR. Em seguida, de acordo com os diferentes links experimentais na detecção de ácido nucleico, classificaremos as principais matérias-primas enzimáticas usadas no processo de detecção de ácido nucleico.

Figura 1. Processo de detecção de ácido nucleico para SARS-CoV-2

2. Enzimas essenciais na extração de ácidos nucleicos

O processo de extração de ácido nucleico do novo coronavírus inclui principalmente duas etapas: lise e purificação. Lise é o processo de destruição da estrutura celular da amostra para que o ácido nucleico na amostra fique livre no sistema de lise; Purificação é a separação completa do ácido nucleico de outros componentes no sistema de lise, como proteína, sal e outras impurezas, e o processo de reação requer a participação de inibidores de proteinase K, desoxirribonuclease I e RNase.

2.1 Protease K

Proteinase K é uma serina protease com ampla atividade de clivagem, os locais de clivagem são as ligações peptídicas carboxi-terminais de aminoácidos alifáticos e aromáticos (Figura 2). No processo de extração de ácido nucleico, a proteinase K pode degradar histonas que se ligam fortemente aos ácidos nucleicos, promovem a separação de ácidos nucleicos e tornam o ácido nucleico da amostra mais fácil de extrair. Além disso, a proteinase K pode degradar a atividade da RNA hidrolase (RNase) e inibir a hidrólise da RNase do RNA molde.

Figura 2. Diagrama esquemático da proteinase K hidrolisando ligações peptídicas

Yeasen Biotecnologia Proteinase K (Cat#10401ES) é derivado de cepa de levedura recombinante, atividade específica ≥30 U/mg, livre de RNase e DNase, e atividade enzimática estável em solução de ureia e SDS. É ativo em uma ampla faixa de pH (pH 4,0~12,0), adequado para clivagem e remoção de proteínas, como preparação de amostra de hibridização in situ e purificação de ácido nucleico.

2.2 Desoxirribonuclease I

A desoxirribonuclease I (DNase I) pode catalisar várias formas de DNA, ter como alvo a clivagem de ligações fosfodiéster adjacentes às pirimidinas e gerar polinucleotídeos com um grupo fosfato na extremidade 5' e um grupo hidroxila na extremidade 3'; o produto médio da digestão é o menor politetranucleotídeo.No processo de extração de ácido nucleico do SARS-CoV-2, a DNase I é usada principalmente para remover contaminação genômica em amostras de RNA, evitar resíduos de DNA em modelos de RNA e melhorar a pureza dos modelos.

Yeasen Biotecnologia DNase I (Cat#10325ES) é derivado de cepas recombinantes de E. coli, livre de RNase, e pode ser usado para o tratamento de várias amostras de RNA. a faixa de pH de trabalho ideal é 7,0-8,0. Na presença de Mg2+, a DNase I pode clivar qualquer sítio de DNA fita dupla aleatoriamente; enquanto na presença de Mn²⁺A DNase I pode clivar o DNA fita dupla no mesmo local, formando extremidades rombas ou extremidades adesivas salientes de 1-2 nucleotídeos (mostrado na Figura 3).

Fig 3. Diagrama esquemático da DNase I clivando dsDNA na presença de Mg²⁺ e Mn²⁺

2.3 Inibidor de RNase

No processo de detecção de ácido nucleico do SARS-CoV-2, a extração e purificação do ácido nucleico da amostra ou a preparação do sistema de reação experimental pode introduzir contaminação por ribonuclease (RNase), resultando na degradação do molde de RNA. Para evitar contaminação por RNase, o Inibidor de RNase é necessário.

O inibidor de RNase é um inibidor de RNase específico na placenta humana, que pode ligar-se especificamente à RNase para formar um complexo com uma ligação não covalente e inativar a RNase. Yeasen Biotech Inibidor de RNase murina (Cat#10603ES) não contém duas cisteínas que são muito sensíveis à oxidação em proteínas humanas. Tem maior atividade antioxidante e pode inibir amplamente vários tipos de RNases (RNase A, B, C), mais adequado para experimentos sensíveis a alto ditiotreitol (DTT), como qPCR.

3. Enzimas centrais durante RT-qPCR

Após a extração de ácido nucleico da amostra de SARS-CoV-2 ser concluída, a detecção de ácido nucleico pode ser concluída por RT-qPCR. No processo desses experimentos, a DNA polimerase, a transcriptase reversa e a uracil DNA glicosilase são todas matérias-primas essenciais da enzima central.

3.1 Transcriptase reversa

Após a extração e purificação, o RNA do SARS-CoV-2 precisa da transcriptase reversa para catalisar a polimerização do dNTP para gerar uma sequência de cDNA complementar ao RNA molde (Figura 4). Para a reação de RT-qPCR, a transcriptase reversa resistente a altas temperaturas deve ser selecionada. Atualmente, a transcriptase reversa do MMLV é a mais amplamente usada, devido à sua falta de atividade de endonuclease de DNA e baixa atividade de RNase H, ela tem mais vantagens na aplicação da clonagem de cDNA.

Figura 4. Diagrama esquemático do processo de transcrição reversa

Yeasen Biotecnologia Hifair™ V Transcriptase Reversa (Cat#11300ES) é uma nova transcriptase reversa obtida por tecnologia de engenharia genética. Ela tem boa estabilidade térmica e pode suportar temperaturas de reação de até 60°C. E também é adequado para transcrição reversa de moldes de RNA com estruturas secundárias complexas. Ao mesmo tempo, a enzima aumenta a afinidade com o molde, é adequada para transcrição reversa de um pequeno número de moldes e genes de baixa cópia, e pode amplificar cDNA de até 10 kb.

3.2 DNA polimerase

Após a conclusão do processo de transcrição reversa do modelo para gerar cDNA de fita dupla, a DNA polimerase "soul player" na reação de PCR precisa aparecer, polimerizando desoxirribonucleotídeos livres para estender a cadeia de DNA, e uma grande quantidade de DNA modelo é amplificada in vitro para atingir o objetivo de detecção de ácido nucleico viral.

A DNA polimerase comumente usada em reações de RT-qPCR é a Taq DNA polimerase hot-start. Esse tipo de enzima é inativa à temperatura ambiente.Ele tem atividade de polimerização somente após partida a quente, o que pode minimizar a geração de sinais de fundo. Ele resolve os problemas de amplificação não específica causada pela geração de primer-dímero ou incompatibilidade em reações de PCR convencionais. Atualmente, os métodos de modificação de partida a quente da DNA polimerase comumente usados ​​incluem principalmente modificação química, modificação de ligante e modificação de anticorpo. Os princípios de diferentes métodos de modificação de partida a quente são mostrados na Figura 5.

Figura 5. Diagrama esquemático de diferentes tipos de enzimas de partida a quente modificadas

Yeasen Biotecnologia UNICONTM Hotstart Alta Taq DNA Polimerase Específica, 5 U/μL (Cat#10726ES) é uma DNA polimerase de dupla ativação e bloqueio com alta afinidade de molde. À temperatura ambiente, não apenas o 5'→3' a atividade da polimerase é bloqueada, mas também o 5'→3' A atividade da exonuclease é bloqueada. A desnaturação a 95 °C por 30 segundos pode inativar completamente o anticorpo bloqueador, liberando a atividade da DNA polimerase e a atividade da exonuclease. O recurso de bloqueio duplo pode não apenas prevenir efetivamente a amplificação não específica causada por incompatibilidades ou primer-dímeros, mas também inibir efetivamente a diminuição do sinal de fluorescência causada pela degradação da sonda. A garantia dupla torna os reagentes de detecção in vitro mais estáveis ​​durante o transporte ou usos em temperatura ambiente.

3.3 Uracila DNA glicosilase

No processo de detecção de ácido nucleico do novo coronavírus, a poluição por aerossol no ambiente operacional é o fator mais comum que causa resultados falso-positivos de PCR. Adicionar a enzima UDG (Uracil DNA Glycosylase, uracil DNA glycosylase) ao sistema de amplificação pode efetivamente eliminar os poluentes residuais de amplificação (principalmente na forma de aerossóis) misturados no sistema de PCR para garantir a precisão dos resultados de amplificação. O princípio antipoluição da enzima UDG é mostrado na Figura 6.

Figura 6. Diagrama esquemático do princípio antipoluição da enzima UDG

Yeasen Biotecnologia Uracil DNA Glycosylase (UDG/UNG), termolábil, 1 U/μL (Cat#10303ES) é ativa a 25-37°C, sensível ao calor e irreversivelmente inativada a 50°C por 10 min ou 95°C por 2 min. Não há resíduos de endonuclease e RNase, e o resíduo do genoma da bactéria hospedeira é menor que 10 cópias. Pode ser usada em conjunto com a Taq DNA polymerase de partida a quente para garantir a especificidade da reação de amplificação.

4.Enzimas essenciais da detecção de ácido nucleico do SARS-CoV-2 a partir de Yeasen

Sobre a leitura:

Seleção de Transcriptase Reversa

YEASEN UDG termolábil ——Controla facilmente a poluição por aerossóis

Inibidores de RNase murina - eliminam com sucesso a contaminação de RNase e preservam o RNA