O sequenciamento de próxima geração (NGS) tem mostrado perspectivas extremamente amplas de aplicação em pesquisas clínicas e científicas em áreas como detecção de patógenos, detecção de mutações tumorais e genética reprodutiva devido à sua alta sensibilidade de detecção, forte especificidade e capacidade de realizar detecção qualitativa e quantitativa. A construção da biblioteca, como uma etapa central do NGS, afeta diretamente a qualidade do sequenciamento. Com base nas diretrizes de revisão de registro para produtos de diagnóstico in vitro (IVD), dados de pesquisa das principais matérias-primas precisam ser fornecidos. Uma análise e verificação abrangentes devem ser realizadas combinando fatores como informações básicas, indicadores de parâmetros e fontes de fornecimento das matérias-primas para determinar a fonte mais adequada de matérias-primas. O processo convencional de construção de bibliotecas de DNA e RNA inclui principalmente etapas importantes, como síntese de cDNA, fragmentação de DNA, ligação do adaptador e amplificação da biblioteca. As várias etapas contêm muitos tipos de enzimas de matéria-prima. A triagem de enzimas de matéria-prima estende o ciclo de pesquisa. Com base nisso, produtos de módulos de construção de bibliotecas simples e econômicos se tornaram uma nova escolha para o desenvolvimento de produtos IVD.
Figura 1. Processo convencional de construção de biblioteca de DNA (esquerda) e processo de construção de biblioteca de RNA (direita), tomando a plataforma Illumina como exemplo
A síntese da transcrição reversa é a parte central de RNA-Seq, Novo tipo de alto eficiência da transcriptase reversa, que integra múltiplas funções, como alta sensibilidade, alta colheita de cDNA e compatibilidade com modelos de estruturas complexas é um ponto importante de pesquisa. A plataforma de modificação enzimática ZymeEditor™ da
Figura 2. Desempenho do 13488ES aplicado em RNA-seq
Limitado pelo curto comprimento de leitura da plataforma de sequenciamento, o DNA precisa ser fragmentado aleatoriamente antes da construção da biblioteca. No estágio inicial, a fragmentação enzimática era assustadora devido a problemas de uniformidade e viés. Biotecnologia
Figura 3. Efeitos de fragmentação de diferentes enzimas de fragmentação de DNA: enzima de fragmentação de ação vigorosa (esquerda) e enzima de fragmentação de ação moderada (direita)
A taxa de conversão da biblioteca é um indicador importante para avaliar a qualidade da biblioteca. Uma alta taxa de conversão da biblioteca, até certo ponto, significa maior riqueza da biblioteca e melhor uniformidade dos dados de sequenciamento. A ligase de DNA T4 convencional se concentra na otimização da ligação de alta eficiência, mas os fragmentos são propensos à autoligação, o que reduz a taxa de conversão da biblioteca e afeta a riqueza da biblioteca e a qualidade do sequenciamento. A plataforma de engenharia enzimática
Figura 4. Estabilidade térmica e análise de resíduos de ligação de 12996ES
Todas as enzimas de amplificação por PCR são necessárias nos métodos de preparação da biblioteca NGS. A maioria das DNA polimerases de alta fidelidade tem atividade de polimerase 5'→3' e atividade de exonuclease 3'→5', Ele pode sintetizar DNA na direção 5'→3' enquanto corrige as bases erroneamente incorporadas, Assim, ele pode amplificar fragmentos de DNA de forma rápida e com alta fidelidade. Mas poucas enzimas são projetadas especificamente para NGS, Não há muitos produtos de amplificação de biblioteca que sejam eficientes, precisos, específicos e capazes de amplificar alvos de diferentes tamanhos e conteúdos de GC sem viés e, ao mesmo tempo, tenham a capacidade de pré-misturar primers com antecedência. A
Figura 5. Análise da taxa de erro de estabilidade e amplificação do 12980ES
Além da série acima de produtos de módulos de construção de biblioteca NGS, Também fornecemos produtos enzimáticos brutos completos, para atender às necessidades combinadas de diferentes clientes. Os produtos de matéria-prima para construção de bibliotecas NGS da
| Categoria do produto | Nome do produto | Cat.No. | Observação |
| Síntese eficiente de cDNA | Hifair™ Transcriptase Ultra Reversa (200 U/μL) | 14604ES | Enzima de transcrição reversa |
| Hieff NGS™ Kit de síntese ds-cDNA | 13488ES | Módulo de síntese de cDNA | |
| ADN Fragmentação e Reparo Final e A-Tailing | Hieff™ Smerase | 12907ES | Fragmentase de DNA |
| Módulo de fragmentação de DNA Hieff NGS™ OnePot Pro (reparo final e dA-tailing plus) | 12619ES | ADN Módulo de Fragmentação e Reparo Final e Resíduos A | |
| Reparo e A-Tailing | Módulo de reparo de extremidade rápida/reboque dA Hieff NGS® | 12608ES | Módulo de reparo final e rejeito A |
| Ligadura adaptadora | 10299ES | Ligase de DNA T4 | |
| Amplificação de biblioteca | 2× Mix de amplificação Ultima HF | 13344ES | Enzima de alta fidelidade |