Guia abrangente para o cultivo organoide

— Um artigo abrangente para aprofundar sua compreensão sobre organoides.

Introdução aos Organoides

Organoides são estruturas tridimensionais com funções fisiológicas que imitam o estado normal (ou doente) de órgãos ou tecidos internos, obtidos por meio do cultivo 3D fora do corpo. Em termos mais simples, organoides são culturas de células tridimensionais onde células-tronco são cultivadas em um gel de matriz. Sob a influência de inibidores/ativadores químicos, citocinas e aditivos de cultura, organoides se desenvolvem em estruturas de tecido semelhantes aos órgãos correspondentes.

Características dos Organoides

Os organoides possuem capacidades de autorrenovação, mantendo a estrutura fisiológica e a função do tecido de origem. Eles são frequentemente chamados de "micro-órgãos em um prato". Utilizando as habilidades de autorrenovação, diferenciação e auto-organização das células-tronco, os organoides podem ser criopreservados para uso em biobancos e podem sofrer expansão ilimitada. Os organoides são altamente complexos e, comparados às células 2D, assemelham-se mais ao estado in vivo.

Figura 1. Cultivo organoide de células de adenocarcinoma de cólon humano [1]

Aplicações de Organoides

A característica distintiva dos organoides é sua capacidade de simular melhor o ambiente in vivo, tornando-os adequados para análises de biologia molecular e celular. Preenchendo a lacuna entre os níveis animal e celular, os organoides oferecem uma solução superior para pesquisa em áreas como estudos de tumores, triagem de medicamentos, medicina regenerativa e muito mais. Eles têm sido amplamente aplicados em indução de tecido funcional, estabelecimento de modelo de doença, triagem de medicamentos, testes anti-inflamatórios, pesquisa clínica e vários outros aspectos de pesquisa, mostrando grande potencial tanto em pesquisa básica quanto em aplicações translacionais.

À medida que os sistemas de cultivo de organoides e as técnicas experimentais continuam a evoluir, os organoides têm sido usados ​​em vários tecidos e órgãos, incluindo intestinos (intestino delgado/cólon), estômago, fígado, coração, pulmões, próstata, pâncreas, rins, mamas, estruturas semelhantes ao cérebro, retina, ouvido interno e muito mais.

Organoides derivados de células-tronco tumorais têm demonstrado potencial significativo na compreensão dos mecanismos de ocorrência e desenvolvimento de tumores, triagem de sensibilidade a medicamentos e promoção de medicina de precisão e diagnóstico personalizado. Vários artigos da Cell and Science indicam que organoides exibem alta sensibilidade e especificidade na previsão da eficácia de medicamentos anticâncer. Recentemente, organoides tumorais demonstraram seu papel na previsão de respostas de pacientes a medicamentos contra câncer e auxiliam na formulação de planos de tratamento personalizados.

Pesquisando Mecanismos de Desenvolvimento: As capacidades de diferenciação dos organoides os tornam adequados para estudar processos e mecanismos de desenvolvimento embrionário. Os processos de indução regulados por vias de sinalização como Wnt e BMP podem ser usados ​​para estudar o desenvolvimento de órgãos como o cérebro, pâncreas e estômago [2][3][4].

Estabelecendo Modelos de Lesões por Doenças: Organoides induzidos de tecidos ou órgãos específicos podem ser usados ​​para estudar modelos de doenças específicas. Equipes lideradas por Zhao Bing e Lin Xinhua usaram modelos de infecção por organoides humanos para estudar os mecanismos moleculares da infecção por SARS-CoV-2 e danos ao fígado, fornecendo ferramentas cruciais para pesquisar os mecanismos patogênicos do vírus e o desenvolvimento subsequente de medicamentos [5]. O grupo de pesquisa liderado por Deng Hongkui na Escola de Ciências da Vida da Universidade de Pequim usou pequenas moléculas e citocinas para estimular a construção de um novo organoide intestinal com características de regeneração de danos — Hiper Organoide.Este organoide pode ser passado e amplificado por um período prolongado, mantendo o genoma e promovendo o reparo dos danos no tecido do cólon, aliviando os sintomas patológicos em um modelo animal de colite aguda e muito mais [6].

Medicina Regenerativa: Organoides derivados de células-tronco podem reparar ou substituir tecidos danificados ou doentes para restaurar a função normal do tecido. Eles têm aplicações extensas em terapia celular, incluindo para outras doenças neurodegenerativas, diabetes, doenças cardiovasculares, distúrbios da retina, lesões da medula espinhal e muito mais. Como um novo tratamento no campo da medicina regenerativa — DA01, usando pequenas moléculas como SB-431542, LDN193189, CHIR-99021, Y-27632 e proteína Sonic Hedgehog (Shh), estimula células-tronco pluripotentes a se diferenciarem em neurônios dopaminérgicos. Esses neurônios são então transplantados para as áreas lesionadas do cérebro de pacientes com doença de Parkinson em estágio avançado, fornecendo uma nova direção e abordagem para o tratamento da doença [7].

Teste de Toxicidade e Eficácia de Medicamentos: Organoides podem ser usados ​​para verificar a farmacotoxicidade de novos medicamentos em órgãos ou tecidos específicos, fornecendo suporte de dados para o desenvolvimento de novos medicamentos. O uso de organoides renais de Hyman para verificar a toxicidade renal da Cisplatina é um exemplo [8].

Triagem de Medicamentos: Organoides derivados de células-tronco podem ser usados ​​para testes in vitro de reações medicamentosas, fornecendo suporte teórico para triagem de medicamentos. Organoides de cólon podem ser usados ​​para estudar planos de medicação para pacientes com mutações CFTR, e organoides tumorais podem ser usados ​​para avaliar situações de medicação individualizadas para pacientes [9].

História do desenvolvimento dos organoides

Fontes de Organoides

Organoides normais originam-se principalmente de células-tronco, incluindo células-tronco pluripotentes (PSCs) e células-tronco adultas (ASCs). Células-tronco pluripotentes incluem células-tronco embrionárias (ESCs) e células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Comparadas às células-tronco pluripotentes, as células-tronco adultas têm a vantagem de serem mais simples e rápidas de modelar, mas a desvantagem de construir estruturas organoides que são relativamente mais simples. Estruturas organoides construídas a partir de células-tronco pluripotentes são mais complexas.

Produtos usados ​​em Cultivo de Organoides

Pequenas moléculas comumente usadas em cultura de organoides (resumo): Super prático, não esqueça de marcar!

❶ Y-27632 (Cat#53006ES, Cat#52604ES): Um potente inibidor de Rock, inibindo competitivamente p160ROCK (Ki=140 nM) e ROCK-II (IC50=800 nM) pela competição de ATP.Também inibe PRK2 (IC50=600 nM). Normalmente adicionado durante a primeira semeadura na cultura de placas; mudanças subsequentes no meio podem não exigir adição. O tratamento de células-tronco embrionárias humanas com Y-27632 (10 µM) por 1 h pode inibir a apoptose, aumentar a eficiência do clone e estender as passagens celulares.

Concentração de trabalho recomendada: 10 μM

❷ SB-202190 (Cat#53005ES): Um inibidor eficiente da cinase p38 MAPK, que tem como alvo p38α/β. O SB202190 pode induzir a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas em células musculares cardíacas, promover a autorrenovação de células-tronco neurais e é aplicável à cultura de organoides gastrointestinais e de glândulas mamárias.

Concentração de dissolução recomendada: Dissolver 10 mg em 3,018 mL de DMSO para obter uma solução de 10 mM; armazenar a -20℃.

Concentração de trabalho recomendada: 10 μM

❸ CHIR-99021 (Cat#53003ES): Um derivado de aminopirimidina, atuando como um inibidor de GSK-3 (GSK3α/β). Ele induz a diferenciação de células-tronco embrionárias humanas no endoderma e é usado em culturas de organoides renais e retinais. CHIR-99021, quando usado em combinação com outros reagentes, estimula a reprogramação de células somáticas em células-tronco.

Concentração de dissolução recomendada: Dissolva 5 mg em 3,58 mL de DMSO para obter uma solução de 3 mM; armazene a -20℃.

Concentração de trabalho recomendada: 3 μM

❹ A 83-01 (Cat#53002ES): Um inibidor da via Activina/NODAL/TGF-β, inibindo a atividade da cinase ALK5/4/7. Geralmente usado na cultura de organoides do fígado, próstata e glândula mamária. É comumente usado para inibir a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e manter a autorrenovação de células in vitro.

Concentração de dissolução recomendada: Dissolva 5 mg em 5,93 mL de DMSO para obter uma solução de 2 mM; armazene a -20℃. (Observação: este produto é instável em solução e é recomendado para uso imediato após a preparação.)

Concentração de trabalho recomendada: 2 μM

❺ Gastrina I (Cat#53007ES): A gastrina é um hormônio peptídico gastrointestinal endógeno que estimula as células da parede gástrica a secretar ácido gástrico. É crucial para estudos sobre organoides gastrointestinais. Ao cultivar organoides intestinais e hepáticos, adicionar gastrina ajuda a prolongar o tempo de sobrevivência dos organoides.

Concentração de dissolução recomendada: Dissolva 1 mg em 2,38 mL de solução de amônia a 1% para obter uma solução de 0,2 mM; armazene a -20℃.

Concentração de trabalho recomendada: 10 nM

❻ Nicotinamida (Cat#51402ES): A nicotinamida, uma vitamina B3, participa de várias reações redox enzimáticas e é usada na cultura de organoides gastrointestinais, hepáticos e de glândulas mamárias. A nicotinamida, em conjunto com citocinas e outros reagentes bioquímicos, exibe propriedades anti-inflamatórias, promove a diferenciação de células-tronco mesenquimais em células produtoras de insulina, inibe a atividade das sirtuínas e é usada para promover a formação de organoides e estender a vida útil dos organoides.

Concentração de dissolução recomendada: Dissolva 100 mg em 8,19 mL de H2O (ou DMSO) para obter uma solução de 100 mM; armazene a -20℃.

Concentração de trabalho recomendada: 10 mM

❼ Forskolin (Cat#51001ES): Forskolin pode ativar a adenilato ciclase, comumente usada para elevar os níveis de AMPc intracelular. Forskolin induz a diferenciação de vários tipos de células, ativa PXR e FXR, e tem efeitos antiagregação plaquetária e anti-hipertensivos. Ao cultivar organoides hepáticos, é essencial adicionar esta substância.

Concentração de trabalho recomendada: 1-10 μM

❽ Prostaglandina E2 (Cat#60810ES): A prostaglandina E2 (PGE2) regula muitos sistemas fisiológicos, mediando a proliferação e diferenciação celular.É necessário no cultivo de organoides hepáticos e prostáticos e está associado ao relaxamento do músculo liso, inflamação, reprodução, regulação do ciclo do sono e integridade da mucosa gástrica.

Concentração de dissolução recomendada: Dissolva 1 mg em 0,28 mL de DMSO para obter uma solução de 10 mM; armazene a -20℃.

Concentração de trabalho recomendada: 500 nM

❾ N-acetil-L-cisteína (Cat#50303ES): N-acetil-L-cisteína (NAC) é um precursor do antioxidante glutationa, com efeitos antioxidantes e inibitórios de ROS. Inibe a apoptose de células neuronais e é necessária no processo de cultura da maioria dos organoides.

Concentração de dissolução recomendada: Dissolva 2 g em 24,51 mL de H2O (ou DMSO) para obter uma solução de 500 mM; armazene a -20℃.

Concentração de trabalho recomendada: 1 mM

Informações relacionadas ao produto

Referências：

[1] Sato T, Stange DE, et al.Expansão de longo prazo de organoides epiteliais do cólon humano, adenoma, adenocarcinoma e epitélio de Barrett. Gastroenterologia. 2011 Nov;141(5):1762-72. doi: 10.1053/j.gastro.2011.07.050. Epub 2011 Set 2. PMID: 21889923.

[2] Lancaster MA, Renner M, et al. Organoides cerebrais modelam o desenvolvimento do cérebro humano e a microcefalia. Natureza. 2013.501(7467):373-379. http://dx.doi.org/10.1038/nature12517.

[3] Greggio C, et al. Nichos tridimensionais artificiais desconstroem o desenvolvimento do pâncreas in vitro. Desenvolvimento. 2013.140(21):4452-4462. http://dx.doi.org/10.1242/dev.096628.

[4] McCracken KW, et al. Modelagem do desenvolvimento humano e da doença em organoides gástricos derivados de células-tronco pluripotentes. Natureza. 2014.516(7531):400-404. http://dx.doi.org/10.1038/nature13863.

[5] Zhao B, Ni C, et al. Recapitulação da infecção por SARS-CoV-2 e danos aos colangiócitos com organoides ductais do fígado humano. Protein Cell. 2020 Out;11(10):771-775. doi: 10.1007/s13238-020-00718-6. PMID: 32303993; PMCID: PMC7164704.

[6] Qu M, Xiong L, et al. Estabelecimento de culturas organoides intestinais modelando a regeneração epitelial associada a lesões. Cell Res. 2021 Mar;31(3):259-271. doi: 10.1038/s41422-020-00453-x. Epub 2021 Jan 8. PMID: 33420425; PMCID: PMC8027647.

[7] BlueRock Therapeutics anuncia primeiro paciente dosado com DA01 em estudo de fase 1 em pacientes com doença de Parkinson avançada. Comunicado à imprensa da BlueRock Therapeutics: 8 de junho de 2021.

[8] Takasato M, Er PX, et al. Organoides renais de células iPS humanas contêm múltiplas linhagens e modelam a nefrogênese humana. Natureza. 2015.526(7574):564-568. http://dx.doi.org/10.1038/nature15695.

[9] Spence JR, Mayhew CN, et al. Diferenciação direcionada de células-tronco pluripotentes humanas em tecido intestinal in vitro. Natureza. 2011.470(7332):105-109. http://dx.doi.org/10.1038/nature09691.