O kit de análise de fragmentos de DNA residual de células hospedeiras HEK293 foi desenvolvido para análise quantitativa de fragmentos de DNA residual HEK293 de vários comprimentos em intermediários, produtos semiacabados e produtos finais de preparações biológicas. Este kit utiliza o princípio da sonda de fluorescência qPCR para detectar específica e rapidamente resíduos de DNA HEK293 abaixo e acima de 200 pares de bases, com um limite de quantificação tão baixo quanto 10 fg/μL. Ele também inclui o HEK293 DNA Control (referência quantitativa de DNA). Este kit pode ser usado em conjunto com os kits de preparação de amostras de DNA residual baseados em esferas magnéticas da empresa (Gato#18461ES/18462ES).

Informações do produto

Componente

Armazenamento e envio:

1. Todos os componentes são enviados em gelo seco e devem ser armazenados de -25°C a -15°C após o recebimento. O prazo de validade é de 2 anos. Os componentes A e B1, B2, B3 e B4 devem ser armazenados protegidos da luz.

2. Após o recebimento, verifique se todos os 7 componentes estão presentes e armazene-os imediatamente nas temperaturas recomendadas.

Precauções:

1. Este produto é destinado apenas para fins de pesquisa.

2. Por razões de segurança e saúde, use jalecos e luvas descartáveis ​​durante a operação.

3. Antes de usar este reagente, leia atentamente o manual de instruções. Os experimentos devem ser conduzidos seguindo procedimentos padrão, incluindo manuseio de amostras, preparação de misturas de reação e pipetagem.

4. Cada componente deve ser bem misturado agitando suavemente e centrifugado brevemente antes do uso.

Instrumentos compatíveis:

Incluindo, mas não se limitando aos seguintes instrumentos: Thermo Scientific: ABI 7500, ABI Quant Studio 5, ABI Step OnePlus, Bio-Rad: Módulo Óptico CFX96, Tecnologia Médica Hongshi de Xangai: SLAN-96S

Instruções de uso

1. Diluição do controle de DNA HEK293 Referência quantitativa e preparação de curvas padrão

O HEK293 Fragment Analysis Kit inclui quatro fragmentos de amplificação de diferentes comprimentos: 82 bp, 133 bp, 227 bp e 515 bp. Ao estabelecer curvas padrão, configure curvas separadas para cada fragmento de amplificação e calcule suas quantidades residuais e distribuições relativas com base nas curvas padrão correspondentes.

Use o Tampão de Diluição de DNA fornecido no kit para executar uma diluição de gradiente da Referência Quantitativa de Controle de DNA HEK293. As concentrações de diluição devem ser: 3 ng/μL, 300 pg/μL, 30 pg/μL, 3 pg/μL, 300 fg/μL e 30 fg/μL.

Os detalhes são os seguintes

1). Coloque o HEK293 DNA Control e o DNA Dilution Buffer do kit no gelo para descongelar. Após o descongelamento completo, agite suavemente no vórtex para misturar e centrifugue brevemente (10 segundos) para coletar a solução no fundo do tubo.

2). Prepare seis tubos de centrífuga limpos de 1,5 mL e rotule-os como Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 e Std5.

3). No tubo rotulado Std0, adicione 90 μL de DNA Dilution Buffer e 10 μL de HEK293 DNA Control para atingir uma concentração de 3 ng/μL. Agite suavemente no vórtice para misturar e centrifugue brevemente (10 segundos). Esta concentração pode ser aliquotada e armazenada a -20°C para uso de curto prazo (até 3 meses). Evite ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.

4). Nos tubos rotulados Std0, Std1, Std2, Std3, Std4 e Std5, adicione primeiro 90 μL de DNA Dilution Buffer a cada um. Cada etapa de diluição deve ser misturada suavemente e centrifugada brevemente para garantir uniformidade. Em seguida, execute o gradiente diluições como segue:

Tabela 1: Diluição do gradiente padrão

* Para cada concentração, realize 3 replicações. Este reagente pode testar dentro de uma faixa linear de 300 pg/μL a 30 fg/μL. Se necessário, a faixa linear pode ser adequadamente estendida ou estreitada.

** Para reduzir os ciclos repetidos de congelamento e descongelamento e evitar contaminação, é recomendado aliquotar e armazenar a quantificação de DNA epadrão a -20°C para o primeiro uso.

*** A diluição de DNA descongelada e não utilizada pode ser armazenada a 2-8°C por até 7 dias. Se não for usada por um longo período, armazene a -20°C.

**** Para garantir a mistura completa do modelo, agite suavemente cada diluição de gradiente por cerca de 1 minuto.

2. Preparação da amostra de teste (TS)

Prepare a amostra de teste TS de acordo com a configuração do experimento, da seguinte forma:

1) Pegue 100 μL da amostra de teste e adicione-a a um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mL. Rotule-o como TS, execute o pré-tratamento da amostra e prepare-o.o Purificaçãoe o amostra de teste.

2) Para atender ao requisito de analisar quatro comprimentos de extensão diferentes simultaneamente, a quantidade de amostra de teste pré-tratada deve ser ≥120 μL. Portanto, é recomendado preparar 2 tubos de cada amostra para pré-tratamento e, após a extração, misturá-los para uso.

3. Preparação do Controle Negativo de Extração (NCS)

Prepare o controle de extração negativo NCS de acordo com a configuração do experimento, da seguinte forma:

1) Pegue 100 μL da solução da matriz da amostra (ou solução de diluição de DNA amortecedor) e adicione-o a um tubo de centrífuga limpo de 1,5 mL. Rotule-o como NCS.

2) Realizar o pré-tratamento da amostra do controle negativo NCS juntamente com o lote de amostras de teste e preparar a solução purificada do controle negativo NCS.

3) Para atender ao requisito de analisar quatro comprimentos de extensão diferentes simultaneamente, a quantidade de amostra NCS pré-tratada deve ser ≥120 μL. Portanto, é recomendado preparar 2 tubos de cada amostra NCS para pré-tratamento e, após a extração, misturá-los para uso.

4. Preparação do Controle Sem Modelo (NTC)

Prepare o NTC de controle sem modelo de acordo com a configuração do experimento, da seguinte forma:

1) Nenhum Controle de Modelo (NTC) não requer amostra pré-tratamento, e pode ser preparado a partir da etapa de detecção do conteúdo residual de DNA usando qPCR.

2) Para cada tubo ou poço, a amostra NTC consiste em 20 μL de mistura (ou seja, 15 μL de HEK293 qPCR Mix + 5 μL de HEK293 Primer & Probe Mix correspondente) + 10 μL de DNA Dilution Buffer. É recomendado preparar o suficiente para 3 poços replicados.

5. sistema de reação qPCR

Mesa 2. Sistema de reação para Fragmento de 82 pb

Mesa 3. Sistema de reação para 133 fragmento bp

Mesa 4. Sistema de reação para 227 fragmento bp

Mesa 5. Sistema de reação para 515 fragmento bp

* Para calcular a quantidade total de mistura necessária para esta reação com base no número de poços:

Mix = (Número de poços de reação + 2) × (15 + 5) μL (para contabilizar a perda dos 2 poços). Normalmente, 3 poços replicados são preparados para cada amostra.

** Número de poços de reação = (5 poços de curva padrão de gradiente de concentração + 1 Controle Sem Modelo (NTC) + 1 Solução de Controle Negativo (NCS) + N Amostras de Teste (TS)) × 3.

NTC (No Template Control): Tampão de diluição de DNA

NCS (Solução de Controle Negativo): Solução de matriz de amostra ou tampão de diluição de DNA após pré-amostra-tratamento para obter a solução purificada, que é o NCS.

TS (Amostra de Teste): A amostra a ser testada.

***Após dispensar as amostras e selar os tubos, centrifugue brevemente em baixa velocidade (10 seg) para coletar o líquido das paredes do tubo para o fundo. Em seguida, agite no vórtice por pelo menos 5 segundos para misturar completamente. Depois, execute outra centrifugação em baixa velocidade (10 seg). Se houver bolhas, certifique-se de removê-las.

Tabela 6: Layout da placa de referência

Este exemplo mostraré o procedimento de detecção de qPCR para analisar os fragmentos de amplificação do DNA residual HEK293.As amostras de teste incluem: 5 gradientes de concentração de curva padrão de DNA HEK293, 1 amostra de teste (TS), 1 solução de controle negativo (NCS) e 1 controle sem molde (NTC). É recomendado executar 3 poços replicados para cada amostra.

6. Parâmetros do programa de amplificação (Ttrês-método passo a passo) (Exemplo usando o instrumento ABI 7500 qPCR, versão de software 2.0)**

1) Crie um novo programa em branco e selecione "Quantificação Absoluta" como modelo de detecção.

2) Para os quatro comprimentos diferentes de fragmentos de amplificação, crie novas sondas de detecção, nomeando-as "HEK293-82", "HEK293-133", "HEK293-227" e "HEK293-515". Selecione o fluoróforo repórter como "FAM" e o fluoróforo supressor como "none". Defina o corante de referência para detecção como "ROX" (o corante de referência pode ser adicionado ou não, dependendo do modelo do instrumento e de outros fatores).

3) No painel "Atribuir alvo(s) aos poços selecionados", defina o campo "Tarefa" para os poços da curva padrão como "Padrão" e atribua os valores correspondentes no campo "Quantidade" como "300000", "30000", "3000", "300", "30" (representando a concentração de DNA por poço, em fg/μL). Nomeie os poços no campo "Nome da amostra" como "300 pg/μL", "30 pg/μL", "3 pg/μL", "300 fg/μL", "30 fg/μL". Para os poços NTC, defina a "Tarefa" como "NTC". Para os poços NCS e TS, defina a "Tarefa" como "Desconhecido" e nomeie os poços "NCS" e "TS" no campo "Nome da amostra". Após definir esses parâmetros, clique em "Iniciar execução" para iniciar a execução do instrumento.

4) Configurações do programa de amplificação: Defina o programa de amplificação de três etapas, com um volume de reação de 30 μL.

Mesa7. Procedimento de PCR

7. Análise de resultados de qPCR

1) No painel "Analysis" em "Amplification Plot", o sistema definirá automaticamente o "Threshold". Às vezes, o "Threshold" padrão fica muito próximo da linha de base, causando variação significativa de Ct entre as réplicas. Você pode ajustar manualmente o "Threshold" para uma posição apropriada e clicar em "Analyze". Neste ponto, você pode verificar preliminarmente as curvas de amplificação no "Multicomponent Plot" para ver se elas estão normais.

2) No painel "Análise" em "Curva Padrão", você pode ler o R² da curva padrão, eficiência de amplificação (Eff%), inclinação e intercepto. Para uma curva padrão normal: R² > 0,99, eficiência de amplificação (90% ≤ Eff% ≤ 110%) e inclinação entre -3,6 e -3,1.

3) No painel "Analysis" em "View well table", você pode ler a coluna "Quantity" para controle sem modelo (NTC), controle negativo (NCS) e amostras de teste (TS), com a unidade em fg/μL. As unidades podem ser convertidas posteriormente no relatório.

4) As configurações de parâmetros para análise de resultados devem depender do modelo específico do instrumento e da versão do software. Normalmente, o instrumento pode interpretar os resultados automaticamente.

5) O valor Ct do controle negativo (NCS) deve ser maior que o valor Ct médio da menor concentração da curva padrão.

6) O resultado do controle sem modelo (NTC) deve ser "Indeterminado" ou ter um valor de Ct ≥ 32.

Documento

Manual