I. Принципы вестерн-блоттинга
Вестерн-блот (ВБ) или иммуноблоттинг белков — это классический метод обнаружения специфических белков на основе взаимодействия антиген-антитело, широко используемый в молекулярной биологии, иммунологии и смежных областях. Его основные этапы включают:
- Разделение белков:
- SDS-PAGE разделяет денатурированные белки по молекулярной массе.
- SDS покрывает белки равномерным отрицательным зарядом, устраняя структурные влияния.
- Мембранный перенос:
- Белки переносятся из геля на мембрану (например, ПВДФ или нитроцеллюлозу).
- Обнаружение антител:
- Первичные антитела специфически связываются с целевым белком, за которыми следуют вторичные антитела, конъюгированные с ферментом (например, HRP), которые генерируют обнаруживаемый сигнал, такой как хемилюминесценция.
II. Стандартный рабочий процесс вестерн-блоттинга
| Шаг | Ключевые процедуры | Рекомендуемые реагенты ( |
| 1. Подготовка образца | Извлечь белки с помощью лизирующего буфера RIPA; добавить PMSF для ингибирования протеаз активность. | Серия лизирующих буферов RIPA, PMSF |
| 2. Количественное определение белка | Используйте метод BCA (Кат#20200ES) для количественного определения; сопоставьте стандартный буфер для разбавления с буфером для образца. | Наборы для количественной оценки BCA (Кат#20200ES/20201ES) |
| 3. Электрофорез в SDS-ПААГ | Используйте готовые гели, поддерживайте напряжение 150 В до тех пор, пока краска не достигнет дна геля. | Готовые гели, загрузочный буфер SDS-PAGE |
| 4. Мембранный перенос и блокировка | Активировать мембрану PVDF (Кат.№36125ES) путем замачивания в метаноле в течение 1 мин; переноса при 300 мА в течение 60 мин в ледяной бане; блокирования при комнатной температуре (RT) в течение 1 ч или использования раствора для быстрой блокировки (Кат.№36122ES) в течение 10 мин. | Трбуфер ANSFER, серия мембран PVDF |
| 5. Инкубация антител | Инкубируйте с первичными антителами при температуре 4°C в течение ночи; со вторичными антителами при комнатной температуре в течение 1–2 часов; тщательно промойте TBST 3 раза. | Разбавитель антител |
| 6.Обнаружение белка | Разрабатывайте с помощью ECL (Кат.№36208ES). | Серия ECL-хемилюминесценции |
Рисунок 1: Рабочий процесс вестерн-блоттинга
III. Распространенные проблемы и решения
| Проблема | Возможные причины | Решения |
| Высокий фон  | Неполная блокировка | Используйте свежий блокирующий раствор и увеличьте время блокировки.. |
| Неправильное мытье | Увеличьте частоту и продолжительность промывания, чтобы удалить неспецифическое связывание. | |
| Избыточная концентрация первичных антител | Разбавьте антитело до соответствующей концентрации. | |
| Проблемы с качеством образцов | Проверьте чистоту и качество образцов; используйте свежие образцы. | |
| Мембранная сушка | Убедитесь, что мембрана остается гидратированной во время инкубации; обеспечьте полный контакт с реакционными растворами. | |
| Слабый или отсутствующий сигнал  | Неполный перевод | Проверьте эффективность переноса и при необходимости отрегулируйте время. |
| Неактивированная мембрана ПВДФ | Замочите ПВДФ в метаноле для активации перед переносом в буфер. | |
| Первичное несоответствие антител целевым видам | Проверьте таблицу данных, сравните последовательности иммуногена и белка и включите широко используемый положительный контроль (например, β-актин в клетках млекопитающих). | |
| Первичная и вторичная несовместимость антител | Убедитесь, что вторичное антитело соответствует виду хозяина первичного антитела. | |
| Недостаточное связывание антител | Увеличьте концентрацию антител и продлите инкубацию при температуре 4°C (например, в течение ночи). | |
| Низкий уровень антигена | Загрузите не менее 20–30 мкг белка на дорожку; используйте ингибиторы протеазы и положительный контроль. | |
| Низкая экспрессия целевого белка | Подтвердите экспрессию в образце с помощью литературы/базы данных; сконцентрируйте образец или используйте контроль с высокой экспрессией. | |
| Неспецифические полосы/множественные полосы  | Избыточно пассированные клеточные линии, изменяющие белковые профили | Используйте клетки с малым количеством пассажей (<15 пассажей) и проводите параллельный контроль с ранними пассажами. |
| Деградация белка | Включить ингибиторы протеазы в лизирующий буфер; хранить при температуре -80°C, избегать замораживания-оттаивания, использовать свежие образцы. | |
| Посттрансляционные модификации | Проверьте литературу на предмет модификаций, влияющих на размер полосы (например, убиквитинирование, гликозилирование). | |
| Множественные варианты сращивания | Проверьте варианты сплайсинга с помощью литературы или баз данных. | |
| Белковые димеры/мультимеры | Добавьте свежий β-меркаптоэтанол или ДТТ в загрузочный буфер SDS. | |
| Экзогенное белковое загрязнение | Проверьте наличие экзогенных белков; при необходимости замените клеточные линии. | |
| Чрезмерная загрузка образца | Оптимизируйте загрузку (20–30 мкг) на основе целевой экспрессии с помощью градиентного тестирования. | |
| Образование мультимера | Кипятите образцы в течение 10 минут для диссоциации мультимеров. | |
| Высокая концентрация первичных антител | Уменьшите концентрацию и/или время инкубации, чтобы избежать появления дополнительных полос. | |
| Высокая концентрация вторичных антител | Снизьте концентрацию и включите только вторичный контроль для снижения неспецифического связывания. | |
| Обнаружение неучтенных белков или членов их семейства | Изучите литературу или BLAST; используйте рекомендуемые линии клеток/ткани. | |
| Если это подтвердится, возможно, вы открыли новый белок! | ||
| Улыбающиеся Полосы  | Быстрая миграция, высокая температура буфера, перегрузка, низкий уровень буфера | Медленная миграция, предварительное охлаждение буфера, снижение белковой нагрузки, обеспечение полного покрытия лунок буфером. |
| Нахмуренные полосы  | Проблемы с устройством (например, пузырьки под гелем) | Отрегулируйте установку, чтобы устранить пузырьки и обеспечить равномерную полимеризацию геля. |
| Хвостовые полосы  | Плохая растворимость образца, деградация, повторно используемый буфер | Тщательно перемешайте образцы, используйте свежие образцы, приготовьте свежий рабочий буфер. |
| Гантели в форме лент  | Неравномерный гель полимеризация, нечистые образцы | Повторно отлить гель для однородности; центрифугировать образцы перед использованием. |
| Размазывание полос  | Чрезмерная загрузка, плохое качество геля | Уменьшите объем образца, улучшите приготовление геля. |
| Следы от пузырей  | Воздух, попавший во время переноса | Удаляйте пузырьки при сборке трансферного сэндвича. |
| Неравномерные черные пятна  | Нерастворенный блокирующий раствор, неравномерное распределение антител | Полностью растворите блокирующий раствор, промойте 3 раза TBST, перемешивайте во время инкубации. |
| Белые пятна  | Высокая концентрация антител, истощающая субстрат | Снижение концентрации первичных/вторичных антител. |
Ⅳ.Инструменты выбора и оптимизации продукции
Сопутствующие товары:
| Процедуры | Кат. № | Название продукта | Технические характеристики |
| Подготовка образца | 20101ES | Лизисный буфер RIPA (сильный) | 100 мл |
| 20115ES | Лизирующий буфер RIPA (средняя среда) | 100 мл | |
| 20114ES | Буфер лизиса RIPA (слабый) | 100 мл | |
| 20118ES | Лизисный буфер для анализов WB/IP | 100 мл | |
| Набор для количественного определения белка BCA (улучшенный) | 500 т/2500 т/5000 т | ||
| Набор для количественного определения белка BCA (готов к использованию) | 500 т | ||
| SDS-PAGE электрофорез | Gold Band Plus 3-цветный маркер белка обычного диапазона (8-180 кДа) | 250 мкл/2×250 мкл/10×250 мкл | |
| GoldBand™ 3-цветный маркер белка высокого диапазона (10-245 кДа) | 2×250 мкл/10×250 мкл | ||
| 20328ES | Набор для приготовления геля SDS-PAGE | 1 комплект (30~50 гелей)/ 1 комплект (150~250 гелей) | |
| Набор для быстрого приготовления геля PAGE | Концентрации: 8%、10%、12.5%、15% | ||
| 36259ES-36280ES | Готовый протеиновый гель Plus | Концентрации: 8%, 10%, 12%, 4-12%, 4-20% Варианты загрузки скважин: 10 скважин、12 скважин、15 скважин | |
|
Мембранный перенос и блокировка | Мембрана PVDF 0,45 мкм (1 рулон, 30 см×3 м) | 1 рулон | |
| Мембрана PVDF 0,22 мкм (1 рулон, 30 см×3 м) | 1 рулон | ||
| Инкубация антител | 36206ES | Первичный и вторичный разбавитель антител для WB | 100 мл/500 мл |
|
Обнаружение белка | Супер ECL-детекторный реагент | 100 мл/500 мл | |
| Улучшенный набор хемилюминесцентных субстратов ECL | 100 мл/500 мл |
В.Как получить поддержку
Для персонализированного устранения неполадок или оптимизации протокола:
- Посещать:
Yeasen Страница продукта вестерн-блоттинга - Электронная почта: info@yeasenbio.com
Золотое правило успеха: Стандартизированные процедуры + высококачественные реагенты + пошаговая валидация = воспроизводимые результаты ВБ!