Mykoplasma, även känd som pleuropneumoni-liknande organismer (PPLO), är de minsta och enklaste prokaryoter som hittills upptäckts och som saknar cellvägg. De har en diameter på 0,1 till 0,3 μm, kan passera genom filter och uppvisar hög pleomorfism. De är relativt vanliga och svåra att upptäcka bakteriella föroreningar i däggdjurscellkulturer
Mykoplasmakontamination har flera negativa effekter på cellkulturer och har blivit ett allvarligt problem i cellodlingsmetoder. Det uppskattas konservativt att mykoplasmakontaminationshastigheten i rutincellkulturer varierar från 15 % till 35 %, vilket allvarligt stör trovärdigheten hos de experimentella resultaten.
Cirka 95 % av mykoplasmakontaminationen i cellkulturer orsakas främst av Acholeplasma laidlawii, Mycoplasma arginini, Mycoplasma orale, Mycoplasma fermentans, Mycoplasma hominis och Mycoplasma hyorhinis. På odlingsmedier bildar mykoplasmakolonier ett "stekt ägg"-utseende. Cellkultursupernatanter och cellmembran ger en lämplig miljö för mykoplasmatillväxt, och mykoplasma som parasiterar cellytan kan penetrera värdcellmembranet.
De huvudsakliga källorna till mykoplasmakontamination inkluderar: cellodlingsmedia eller dess komponenter (såsom råmaterial för mediet, serum och andra reagenser), laboratoriepersonal, cellodlingsinkubatorer, lagringstankar för flytande kväve, luftburna partiklar och aerosoler, överanvändning av antibiotika, felaktigt förseglade cellkulturer och celler som redan är kontaminerade med mycoplasma.
Samtidigt inkluderar motsvarande risker med dessa föroreningar: leder till partiskrotning av cellprodukter eller produkter producerade med användning av celler som medium på grund av oförmågan att effektivt avlägsna mykoplasma under nedströmsrening; kontaminering av all relaterad utrustning och anläggningar, såväl som mellanprodukter eller slutprodukter, som kommer i kontakt med det kontaminerade materialet; orsakar att andra normala celler kontamineras av mykoplasma; vilket resulterar i skrotning av viktiga cell- eller virala fröbankar på grund av mykoplasmakontamination; tvingar laboratoriet att stoppa produktionen eller experimentella operationer för att ta itu med mykoplasmakontaminationen; leder till utveckling av mykoplasmasistens, vilket gör det ännu svårare att eliminera; utvidga området för mykoplasmakontamination; och utgör ett hot mot andra cellkulturer i laboratoriet.
Därför måste regelbundna tester och avlägsnande av mykoplasma utföras för att säkerställa att ingen mykoplasma finns i cellodlingssystemet, vilket är väsentligt för den normala vetenskapliga forskningen.
Mykoplasma Upptäckt
Mykoplasma är en relativt vanlig men vanligtvis svår att ta bort typ av kontaminering. För biologiska processer som involverar cellodling kräver bestämmelser att "det inte får finnas någon mykoplasmakontamination."
- 2020-utgåvan av den kinesiska farmakopén, volym III, "Förberedelse och kvalitetskontroll av animaliska cellsubstrat för produktion och testning av biologiska produkter", föreskriver att för celler som används i produktionen måste mykoplasmatester utföras på Master Cell Bank (MCB), Working Cell Bank (WCB) och End-of-Production Cells (EOPC).
- FDA, Guidance for Industry: Karakterisering och kvalificering av cellsubstrat och andra biologiska material som används vid framställning av virusvacciner för indikationer på infektionssjukdomar, stipulerar att mykoplasmakontroll måste utföras på råvaror, virusfrön, obearbetade skördevätskor och andra sådana material.
- ICH Q5D, 'Derivation and Characterization of Cell Substrates Used for Production of Biotechnological/Biological Products', nämner också att mykoplasmakontroll måste utföras på råvaror, virusfrön, obearbetade skördevätskor och andra sådana material.
Figur 1 Mycoplasma-kontaminationstestpunkter som krävs av nationella och internationella bestämmelser
Traditionella metoder för detektering av mykoplasma inkluderar främst odlingsmetoder och metoder för indikatorceller. På grund av de långa upptäcktscyklerna eller känslighetsproblemen för dessa två metoder leder de dock till förlängda produktions- eller produktutsläppscykler för företag. Med utvecklingen av cell- och genterapi har industrins krav på aktualitet och känslighet för mykoplasmadetektion blivit allt strängare. Korta hållbarhetstider är otillräckliga för att stödja så långa detektionsperioder, varför den snabba NAT-metoden (Nucleic Acid Testing) har stuckit ut bland olika mykoplasma-detektionsmetoder.
Figur 2 Mykoplasma-detektionsmetoder listade i nationella och internationella bestämmelser
Baserat på NAT (nukleinsyraförstärkningstekniker) har Yeasen utvecklat en serie snabba mykoplasmadetektionskit, inklusive Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit, MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection Kit och GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit.
1.Mycoplasma qPCR-detektionssats i realtidDet är en produkt för snabb kvalitativ detektering av potentiell mykoplasmakontamination i produktionsråmaterial, cellbanker, virala frön, virala eller cellskördande vätskor och terapeutiska celler. Det används främst i forskning, utveckling, produktion och frisättningsprocesser av bioläkemedel.
Produktkvalifikationer
Regelefterlevnad: Validerad enligt kraven i EP2.6.7, JP G3 och USP 63 farmakopéer, som uppfyller standarderna för internationella auktoritativa organisationer.
Revisionsefterlevnad: Produkttillverkningen följer ISO13485 kvalitetsledningssystemstandarder och stöds av omfattande revisionsdokumentation.
Kvalitetssäkring: Alla enzymråvaror som krävs för kitet är egentillverkade och har industrialiserats, vilket säkerställer en stabil försörjning.
Ackumulering av teknisk erfarenhet: Det finns en solid teknisk grund i TaqMan-metoden, och kitsens känslighet kan nå 10 CFU/ml och lägre.
Fokus på produktprestanda: Taq-enzymantikroppsbiblioteket, med dubbelblockerande antikroppar, förbättrar satsens specificitet, känslighet och stabilitet.
Produktegenskaper
Flera detektionstyper: Optimerade TaqMan-sonder kan detektera upp till 183 mykoplasmaarter.
Lätt att använda: Den totala tiden för provberedning och testning är mindre än 3 timmar, vilket eliminerar behovet av en 28-dagars väntan i samband med odlingsmetoder.
Hög känslighet: Detektionsgränsen är så låg som 10 CFU/mL, vilket gör det till ett lönsamt alternativ till direktodlingsmetoder.
Hög specificitet: Primers och prober är utformade för att rikta in sig på 16S rRNA, vilket säkerställer ingen korsreaktion med närbesläktade arter som klostridier och laktobaciller.
Hög säkerhet: Den positiva kontrollen (PC) i satsen är icke-infektiös, vilket helt eliminerar risken för kontaminering.
Starkt interferensmotstånd: Införandet av en intern kontroll (IC) hjälper till att utesluta provinterferens och abnormiteter vid reaktionsberedning, vilket effektivt undviker falska negativ.
Figur 3 Arbetsflöde för Mycoplasma Detection med Mycoplasma Real-time qPCR Detection Kit
2. MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection KitDen använder en unik isotermisk förstärkningsteknik som erbjuder högre färgskillnad. Förändringen från blåviolett (negativ) till himmelsblå (positiv) är lättare att urskilja med blotta ögat. Dessutom innehåller den antikontamineringskomponenter för att eliminera förekomsten av falska positiva.
Figur 4: Användningsprocedur för Mycoplasma Detection med MycAway™ Plus-Color One-Step Mycoplasma Detection Kit
3.GMyc-PCR Mykoplasma UpptäcktUtrustningTill skillnad från konventionella enstegs PCR-detektionsmetoder ökas antalet primrar från ett par till tre par, och riktar sig mot de konserverade regionerna av mycoplasma 16S och 23S rRNA för kapslad PCR-amplifiering. Detta minskar inte bara ospecifika produkter utan ökar också avsevärt produktens känslighet, vilket möjliggör detektering av så få som en enda kopia av mykoplasma.
、
Figur 5 Användningsprocedur för Mykoplasma-detektion med GMyc-PCR Mycoplasma Test Kit
Mykoplasma borttagning
I processen med cellodling kan regelbunden testning effektivt förhindra storskalig mykoplasmakontamination. Men om cellerna redan är kontaminerade med mykoplasma måste de hanteras snabbt. Det bästa är att sterilisera de kontaminerade cellerna under högt tryck och sedan kassera dem för att undvika att kontaminera andra rena cellinjer. Om de kontaminerade cellerna är särskilt värdefulla och det är nödvändigt att avlägsna mykoplasmakontaminationen, kan en kombination av antibiotika användas för att uppnå detta mål. Eftersom mykoplasma saknar cellvägg är traditionella antibiotika i allmänhet ineffektiva mot dem. Därför är det avgörande att välja ett lämpligt mykoplasmaborttagningsreagens.
Yeasens MycAway™ Treatment (1000×) är ett blandat antibiotikapreparat som innehåller tre komponenter med antimikrobiella effekter på mykoplasma: kinoloner, tetracyklinderivat och makrolidantibiotika. Detta mykoplasmaborttagningsreagens uppnår effektiv mykoplasma-clearance genom att hämma DNA-syntes och produktionen av proteiner som är nödvändiga för mykoplasmatillväxt, utan att skada cellerna. Det maximerar cellräddningen och minimerar förluster på grund av mykoplasmakontamination.
Produktegenskaper
Låg toxicitet: Minimal toxicitet för celler, vilket säkerställer ingen störning med efterföljande cellexperiment som transfektion och viabilitetsanalyser.
Hög stabilitet: Reagenset kan förvaras under lång tid vid -20°C och bibehåller sin höga effektivitet.
Lätt att använda: Lägg bara till produkten i det mykoplasma-kontaminerade odlingsmediet och inkubera.
Snabbverkande: "Omedelbara resultat", med effekter synliga så snabbt som inom 3 dagar.
Brett spektrum: Kan ta bort majoriteten av mykoplasmatyper som finns i laboratorier.
Bild 6.Illustration av Mycoplasma Removal Reagent Cytotoxicity Test
Förebyggande av mykoplasma
I processen med cellodling uppstår ofta mykoplasmakontamination. Men på grund av dess unika egenskaper är det svårt att upptäcka med blotta ögat eller mikroskopisk utrustning. Därför är det särskilt viktigt att göra ett bra jobb för att förebygga mykoplasma. Effektivt förhindrande av mykoplasmakontamination kan uppnås genom att tillsätta mykoplasmaförebyggande reagenser till odlingsmediet.
För närvarande härrör mykoplasma i laboratorier huvudsakligen från: korskontaminering mellan celler, kontaminering av arbetsmiljön eller laboratorieutrustning, dåliga aseptiska tekniker av experimentörer, kontaminerade odlingsmedier eller reagenser, och ursprungliga vävnader eller organ med mykoplasmakontamination. Produktserien för förebyggande av mykoplasma som utvecklats av Yeasen har enkelhet, bekvämlighet och hög stabilitet, vilket gör den mycket lämplig för förebyggande av mykoplasma i rutinmässiga cellinjekulturer.
Produktinformation
| Produkt | Katalognummer | Produktnamn | produktspecifikation |
| Prov förbehandlingssats | 18461ES | 25T/100T | |
| 18467ES | MolPure® Mag48 provberedningssats FN | 3×16T/ 6×16T | |
| Nukleinsyraextraktionsinstrument | 80511ES | 48-kanals automatisk nukleinsyraextraktor | 48 Kanal |
|
Mycoplasma Detection Kit | 40619ES | MycAway® Mycoplasma qPCR-detektionssats i realtid (2G)
| 25T/100T |
| 40612ES | 25T/100T | ||
| 40601ES | 10 analyser/20 analyser | ||
| Reagens för borttagning av mykoplasma | 40607ES | 1mL/5×1mL
| |
|
Mycoplasma Prevention Reagens | 40608ES | MycAwayTM Profylaktiskt (2000×) -Mycoplasma Prevention Reagens | 1mL/5×1mL
|
| 40605ES | MycAwayTM Spray (färdig att använda) | 500mL/2×500mL/10×500mL
| |
| 40609ES | MycGuardTM-1 Lösning (100×), för desinficering av vattenbad i CO2-inkubator | 100 ml | |
| 40610ES | MycGuardTM-2 Lösning (500×), för desinficering av vanligt vattenbad | 100 ml |