Isotermisk amplifieringsteknologi kan uppnå syftet att amplifiera specifika nukleinsyrasekvenser under konstanta temperaturförhållanden. På grund av egenskaperna hos ingen speciell utrustning, kort förstärkningstid och hög känslighet, har den visat goda tillämpningsmöjligheter inom detektion på plats och punkt-of-care-diagnos och är mycket lämplig för utveckling av molekylära diagnostiska verktyg.

I samband med den nya coronavirus-pandemin med ökande stammar och smittsamhet, kan isotermisk amplifieringsteknik upptäcka det nya coronaviruset snabbt med enkla instrument, vilket hjälper till att lösa problemet att vissa COVID-19-patienter inte snabbt kan bekräftas på grund av den långa upptäcktstiden och höga krav på detektionsutrustning och reagenser från traditionella PCR-tekniker. Så vad är principen för RT-LAMP, en av de isotermiska amplifieringsteknikerna? Vilka är de högkvalitativa råvarorna som Yeasen kan tillhandahålla?

1. Vad är principen för RT-LAMP?
2. Primerdesign för RT-LAMPA
3. Vilka råvaror kan Yeasen tillhandahålla?
4. Produktvalsguide

1. Vad är principen för RT-LAMP?

År 2000 etablerade japanska forskare Notomi och andra en ny nukleinsyraamplifieringsteknologi som kallas loop-medierad isotermisk amplifiering (LAMP). LAMP använder 4 specifika primrar designade för 6 regioner av målgenen och använder DNA-polymeras för strängförskjutning för att amplifiera 109 kopior av målsekvensen på tiotals minuter under isotermiska förhållanden (60~65 ℃). Resultaten bedömdes genom agarosgelelektrofores, och de positiva resultaten visade stegformade band. LAMPA har egenskaperna stark specificitet, hög känslighet, snabb och enkel drift och låg kostnad. Med den kontinuerliga förbättringen och perfektionen av denna teknik används den för närvarande vid upptäckt av olika patogena mikroorganismer.

RT-LAMP är en metod där omvänt transkriptas läggs till LAMP-amplifieringssystemet, vilket kan realisera direkt detektering av viralt RNA. Amplifieringseffektiviteten för LAMP är extremt hög, så en stor mängd nukleinsyra kan amplifieras med endast en liten mängd cDNA. Tiden för omvänd transkription i nukleinsyraamplifieringsprocessen sparas och detektionshastigheten för RNA accelereras.

DNA är i ett tillstånd av dynamisk jämvikt vid cirka 65 ℃. Under verkan av DNA-polymeras med strängförskjutning, med start från 3'-änden av F2-segmentet av FIP-primern, paras det med den komplementära sekvensen av mall-DNA:t för att initiera syntes av DNA-strängförskjutning. F3-primern är komplementär till F3c vid den främre änden av F2c och tar 3'-änden som utgångspunkt för att syntetisera dess DNA samtidigt som den ersätter DNA-strängen som syntetiserats av den ledande FIP-primern genom verkan av ett DNA-polymeras med strängförskjutning. Förläng framåt. DNA-strängen som syntetiseras av den slutliga F3-primern bildar en dubbelsträng med en mall-DNA-sträng. DNA-strängen som syntetiseras av FIP-primern ersätts av F3-primersträngen för att generera en enkelsträng. Denna enkelsträng har komplementära F1c- och F1-segment vid 5'-änden, så självbasparning utförs för att bilda en cirkulär struktur. Och BIP-primern hybridiseras och kombineras med enkelsträngen, och 3'-änden av BIP-primern används som utgångspunkt för att syntetisera en komplementär sträng, och strukturen öppnas i processen.Sedan sätts primrar liknande F3 och B3 in från BIP-primern, baskomplementär parning utförs och en ny komplementär sträng syntetiseras från 3'-änden som utgångspunkt. Det finns komplementära sekvenser i båda ändarna av det ersatta enkelsträngade DNA:t, och självbasparning sker för att bilda en cirkulär struktur, så hela kedjan uppvisar en hantelliknande struktur. Denna struktur är startstrukturen för amplifieringscykeln för RT-LAMP-metoden.

I den hantelformade strukturen utförs DNA-förlängningen med användning av F1-segmentet vid 3'-änden som utgångspunkt och med sig själv som mall. Och FIP-primern F2 hybridiserar med enkelsträngad F2c på slingan för att initiera en ny omgång av strängförskjutningsreaktion. Den dubbelsträngade nukleinsyran som syntetiseras från F1-segmentet dissocieras och på liknande sätt bildas en cirkulär struktur på nukleinsyran. Det finns en enkelsträngad form av B2c på den cirkulära strukturen, och B2 på BIP-primern hybridiserar med den för att initiera en ny omgång av amplifiering, och en cirkulär struktur bildas genom samma process. Enligt denna process cirkulerar komplementära sekvenser på samma sträng genom parning, strängförlängning och bildar slutligen strukturer av olika storlekar.

2. Primerdesign för RT-LAMPA

Primerdesign är nyckeln till framgångsrik amplifiering och detektion av RT-LAMP. RT-LAMP primers inkluderar två yttre primers (F3 och B3) och två inre primers (FIP och BIP). F3-primer: Den uppströms yttre primern, som består av F3-regionen, är komplementär till F3c-regionen av målgenen. FIP-primer: uppströms intern primer, bestående av F2-regionen, F2c-regionen vid 3'-änden av målgenen i F2-regionen är komplementär till F1c-regionen vid 5'-änden av målgenen. BIP-primer: nedströms intern primer, sammansatt av B2-regionen, B2-regionen är komplementär till B2c-regionen vid 3'-änden av målgenen och har samma sekvens som B1c-regionen vid 5'-änden av målgenen.

I likhet med PCR bör primerdesignprinciper vara uppmärksamma på faktorer som bassammansättning, GC-innehåll och understruktur. Dessutom bör följande punkter noteras. 5'-änddelarna av de inre primrarna FIP och BIP, dvs F1c och B1c, är i allmänhet 8-50 bp långa. Längden är företrädesvis 15 till 25 bp, och Tm-värdet är större än Tm-värdena för F2 och B2 vid 3'-änddelen. 3'-änddelarna av de inre primrarna FIP och BIP, dvs F2 och B2, är i allmänhet 8-50 bp långa. Längden är företrädesvis 15-25 bp, och Tm-värdet överensstämmer med den optimala temperaturen för Bst-DNA-polymeraset som valts i experimentet. Längden på de yttre primrarna F3 och B3 är i allmänhet 8-50 bp. Längden är företrädesvis 15-25 bp, och dess Tm-värde är mindre än det för F2 och B2. Vid design av primrar bör loopstrukturen och storleken på målsekvensen beaktas. När antalet baser i slingan är större än 40 bp och storleken på målsekvensen är 130-200 bp, är amplifieringseffektiviteten högst.

3. Vilka råvaror kan Yeasen tillhandahålla?

3.1 [Ny uppgradering] Yeasen Bst Plus DNA-polymeras

Den nyuppgraderade Hieff™ Bst Plus DNA-polymeras (Katt#14402ES, 14403ES) erhålls genom att uttrycka och rena DNA-polymerasgenen från Bacillus stearothermophilus sp saknar 5′→3′ exonukleasdomänen i E.coli.Enzymsträngsförskjutningsförmågan är stark och har fördelarna med hög känslighet, hög amplifieringseffektivitet och hög dUTP-tolerans, och kan användas i stor utsträckning vid realtidsdetektering av patogener baserad på isotermisk amplifieringsteknologi.

3.1.1 Snabb och hög känslighet

Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA-polymeras har hög känslighet och kan detektera målgenen så lite som 5 kopior. Mängden mall är på femtogramnivån (fg), och förstärkningshastigheten är snabbare än konkurrerande produkter.

Figur 1. RT-LAMP-reaktion utfördes med Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA-polymeras (orange) och Bst-enzymer från konkurrent N (grå) och konkurrent T (blå) för att amplifiera SARS-CoV-2. Resultaten visar att Yeasen Hieff™ Bst Plus DNA-polymeras alltid kan nå tröskeln snabbare än konkurrerande produkter, och amplifieringshastigheten är snabbare.

4. Produktvalsguide

Produkterna som tillhandahålls av Yeasen är följande:

Tabell 1.Produktinformation