Den dubbelblock anti-TAQ DNA-polymerasantikroppen för att minska ospecifik amplifiering

Molekylär diagnos är det snabbast utvecklande delområdet inom området IVD. Det har fördelarna med kort detektionstid, hög känslighet och stark specificitet. Det används i stor utsträckning vid samtidig tumördiagnostik och screening av infektionssjukdomar och genetiska sjukdomar. Inom området molekylär diagnos är PCR inte bara den mest mogna teknologiplattformen med den största marknadsandelen utan också "guldstandard"-tekniken för klinisk diagnos. I den traditionella PCR-reaktionen uppstår ofta problemet med ospecifik amplifiering. Ospecifik amplifiering påverkar direkt tolkningen av detektionsresultat och kommer att leda till minskningen av amplifieringskänsligheten och till och med utbytet av målfragment. Hur uppstår ospecifik amplifiering och hur kan den effektivt undvikas?

1. Konventionellt DNA-polymeras kan leda till ospecifik amplifiering

2. Varmstartspolymeras kan förbättra amplifieringsspecificiteten

3. Dubbelblockerande Taq-antikropp kan dubbelt förbättra amplifieringsspecificitet och stabilitet

4. Prestandavisning av Yeasens Double-Block Taq antikropp

5. Produktinformation

1. Konventionellt DNA-polymeras kan leda till ospecifik amplifiering

Den dåliga sekvensspecificiteten för primrar är den direkta orsaken till ospecifik amplifiering. Som promotor för konventionellt DNA-polymeras kan dess exonukleasaktivitet trunkera DNA-primersekvensen under framställningen av PCR-systemet, för att reducera specificiteten hos primrar.

Dessutom har konventionellt DNA-polymeras inte bara exonukleasaktivitet utan har också polymerasaktivitet. Även om den optimala förlängningstemperaturen för DNA-polymeras är 72 ℃, är polymeraset fortfarande aktivt vid rumstemperatur. Under beredningen av PCR-reaktionen och den initiala uppvärmningsprocessen kan därför primrar bilda ospecifik bindning med vissa enkelsträngade mallar och sträcka sig under verkan av Taq DNA-polymeras, vilket resulterar i amplifiering av icke-målsekvenser och påverkar reaktionens specificitet.

Därför är PCR-system ofta konfigurerade på is för att hämma aktiviteten av DNA-polymeras. Även om denna metod är enkel och billig, kan den inte helt hämma enzymaktiviteten, så den kan inte eliminera amplifieringen av ospecifika produkter.

2. Varmstartspolymeras kan förbättra amplifieringsspecificiteten

Varmstartspolymeras är kärnkomponenten i varmstarts-PCR. Vid rumstemperatur blockeras det aktiva stället för DNA-polymeras av en enzymmodifierare. Först efter PCR-denaturering vid 95 ℃, faller enzymmodifieraren av och enzymaktiviteten startas, vilket undviker ospecifik amplifiering orsakad av enzymet.

För närvarande inkluderar de vanligaste hot-start-modifieringsmetoderna för DNA-polymeras på marknaden huvudsakligen en kemisk metod, ligandmetod och antikroppsmetod. Bland dem är den blockerande effekten av antikroppsmodifierat varmstartspolymeras den bästa, och frisättningshastigheten för enzymaktivitet är snabb, vilket avsevärt kan minska reaktionstiden för PCR. Det är en hetstartsmetod för enzymmodifiering som ofta används på IVD-marknaden.

Det bör dock noteras att den traditionella antikroppshotstartmetoden endast blockerar 5'→3'-polymerasaktiviteten hos Taq DNA-polymeras, vilket endast kan förhindra ospecifik amplifiering orsakad av felparning eller primerdimer vid låga temperaturer.Som nämnts ovan har emellertid Taq DNA-polymeras inte bara 5'-→3'-polymerasaktivitet utan har också 5'-→3'-exonukleasaktivitet. Denna exonukleasaktivitet kan leda till nedbrytning av felmatchade prober eller andra material vid låga temperaturer, vilket resulterar i vissa ospecifika signaler.

3. Dubbelblockerande Taq-antikropp kan dubbelt förbättra amplifieringsspecificitet och stabilitet

Som en innovativ ledare inom den inhemska molekylära enzymindustrin fokuserar Yeasen Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd. (hädanefter kallat Yeasen) på FoU och produktion av molekylära enzymråvaror och vågar förnya sig. Den förlitar sig på sin egen screeningplattform för mogna antikroppar och screenar den blockerande antikroppen med Taq DNA-polymeras som målmolekyl. Efter år av mödosam forskning och systemoptimering har den utvecklats dubbelblockad anti-Taq DNA-polymerasantikropp, Det kan inte bara blockera polymerasaktiviteten hos Taq DNA-polymeras utan också blockera exonukleasaktiviteten hos Taq DNA-polymeras. I ett tvådelat tillvägagångssätt kan det inte bara effektivt förhindra ospecifik amplifiering orsakad av felparning eller primerdimer, utan också förhindra materialnedbrytning från att generera ospecifika signaler och dubbelt förbättra reagensens stabilitet.

4. Prestandavisning av Yeasens Double-Block Taq antikropp

4.1 Användningen av Double-Block Taq Antibody är exakt och känsligare

Efter blockering av Taq-polymeras med Yeasens dubbelblockerande antikropp och T-företagets antikropp upptäcktes de positiva proverna med ARMS-PCR.

Figur 1. ARMS-PCR amplifieringskurva; Blå: T-företagets blockerande antikropp; Röd: Yeasens dubbelblocksantikropp

Det kan ses från figur 1 att Taq-polymeraset blockerat av Yeasens dubbelblocksantikropp har noggrann typning och högre känslighet vid ARMS-PCR-amplifiering.

4.2 Dubbelblockerande Taq-antikropp effektivt Blockerade exonukleasaktiviteten hos Taq DNA-polymeras

De syntetiserade primerproberna matchades med reaktionslösningen av Taq DNA-polymeras blockerad av oslutna respektive dubbelblockerade antikroppar och reagerade vid 40 ℃ för att detektera deras fluorescenssignaler från dem.

Figur 2. Detektion av blockeringseffektivitet för dubbelblockad antikropp för exonukleasaktivitet; Gul: osluten Taq DNA-polymerasgrupp; Lila: Taq DNA-polymerasgrupp blockerad av dubbelblockad antikropp

Det kan ses från bild 2 att dubbelblock-antikroppen effektivt kan blockera exonukleasaktiviteten hos Taq DNA-polymeras.

4.3 Dubbelblockerande Taq-antikropp kan effektivt förbättra stabiliteten hos detektionsreagens

Taq DNA-polymeras blockerades med traditionell blockerande antikropp respektive dubbelblockerande antikropp och konfigurerades till en fullständig förblandning innehållande primersond. 10 000 kopior av ASF-plasmid amplifierades vid 4°C i 10 dagar eller vid 37°C under 1, 3 och 5 dagar. Amplifieringskurvan och förändringar i Ct-värdet observerades, och effekterna av traditionella blockerande antikroppar och dubbelblockerande antikroppar på stabiliteten hos full förblandningsreaktionslösning jämfördes.

Figur 3.Amplifieringskurva av 10 000 kopior av ASF-plasmid amplifierad med traditionell blockerande antikropp (a) och dubbelblockerande antikropp (b) blockerande reaktionslösning; Blå: lagra vid 4 ℃ i 10 dagar; Röd: placerad vid 4 ℃ i 0 dagar (kontroll)

Det kan ses från figur 3 att dubbelblockeringsantikroppen kan bibehålla stabiliteten hos reaktionslösningen och effektivt förbättra stabiliteten hos detektionsreagenset än den traditionella blockerande antikroppen. Amplifieringskurvan och Ct-värdet ändrades inte signifikant efter att hela förblandningen innehållande primerproben blockerades av en dubbelblockad antikropp och placerades vid 4 ℃ i 10 dagar.

Figur 4. Amplifieringskurva för 10 000 kopior av ASF-plasmid amplifierad med traditionell blockerande antikropp (a) och dubbelblockerande antikropp (b) blockerande reaktionslösning; Blå: lagra vid 37 ℃ i 5 dagar; Grön: 37 ℃ i 3 dagar; Gul: 37 ℃ i 1 dag; Röd: placerad vid 37 ℃ i 0 dagar (kontroll)

Det kan ses från figur 4 att dubbelblockeringsantikroppen kan bibehålla stabiliteten hos reaktionslösningen och effektivt förbättra stabiliteten hos detektionsreagenset än den traditionella blockerande antikroppen. Dubbelblockad antikropp blockerar hela förblandningen som innehåller primer-proben, och skillnaden i Ct-värde är mindre än 0,2 efter att ha placerats vid 37 ℃ under 1, 3 och 5 dagar.

4.4 Dubbelblockerande Taq-antikropp hjälper till att lösa problemet med baslinjedrift

När vissa primrar samarbetar med en specifik buffert och instrument, kommer det att finnas baslinjedrift. Yeasen försökte många metoder för att förbättra baslinjeproblemet och fann att dubbelblockad antikropp var mer gynnsam för en stabil baslinje.

Figur 5. Amplifieringskurva för N-genen (a) och ACT-genen (b); Röd: traditionell blockerande antikropp; Grön: dubbelblockad antikropp

Som kan ses från figur 5 kan användningen av dubbelblockerande antikroppar under specifika primrar och buffertar hjälpa till att lösa problemet med baslinjedrift.

4.5 God linjäritet erhölls med hjälp av dubbelblockad Taq-antikropp

100000, 10000, 1000 och 100 kopior av ASF/ACT-dubbelplasmider amplifierades med reaktionslösningen blockerad av en dubbelblockad antikropp, och standardkurvan gjordes.

Figur 6. Standardkurvor för ASF-genen (a) och ACT-genen (b) producerade av dubbelblocksreaktionslösning

Som framgår av figur 6 är standardkurvan R2 av ASF-genen är 0,998 och amplifieringseffektiviteten är 98,848%; Standardkurvan R2 av ACT-genen var 0,998 och amplifieringseffektiviteten var 98,113 %.

4.6 Dubbelblockering Taq Antikroppar kan snabbt frigöra enzymaktivitet

Taq-polymeras blockerades med importerade T-företags antikropp och Yeasens dubbelblocksantikropp (katt#31303) respektive enzymaktiviteten detekterades efter värmechock vid 95 ℃ under 20 s. Det kan ses att 31303 kan frigöra mer än 95 % av enzymaktiviteten efter värmechock vid 95 ℃ i 20 s, vilket motsvarar T-företagets antikropp.

Tabell 1. Enzymaktivitet

4.7 Dubbelblockering Taq Antikropp Kan blockera många typer av Taq-enzymer

Tre typer av Taq-enzymer (vildtyp och 2 mutanter) blockerades av Yeasens dubbelblocksantikropp (kat#31303), och blockeringsförhållandet var 1 μg: 5 U, vilket mätte fluorescensvärdet och tätningseffektiviteten. Man kan se att den blockerande effekten av Yeasens dubbelblockerande antikropp (kat#31303) är bättre för olika typer av Taq-enzymer.

Tabell 2. Blockeringseffektivitet för olika typer av Taq-enzymer

4.8 Yeasens Dubbelblockad Taq-antikropp hade ingen genomisk rest i möss

Med vatten som mall för den negativa kontrollen och musgenomet som mall för den positiva kontrollen amplifierades 31303 olika batcher. Det visade sig att målfragmentet inte amplifierades i provet, vilket indikerar att det inte fanns någon musgenomrest i antikroppen.

Figur 7. Detektionsdiagram för musgenomrester

Notera: - är den negativa kontrollen, + är en positiv kontroll, och 1-5 är 31303 prover av olika batcher

5. Produktinformation