Olika typer av magnetiska pärlor i NGS: DNA\RNA\mRNA magnetiska pärlor
Magnetiska pärlor är en av de nödvändiga produkterna vid konstruktionen av sekvenseringsbibliotek med hög genomströmning. De kan rena DNA eller RNA, screena DNA-fragment av målstorlek och berika målnukleinsyror. Med utvecklingen av sekvenseringsteknologi har magnetiska pärlor specialiserade på olika applikationsområden uppstått, inklusive magnetiska pärlor för DNA-rening, magnetiska pärlor för urval av DNA-storlek, magnetiska pärlor för RNA-rening och magnetiska pärlor för mRNA-anrikning. Så vad är principerna för olika magnetiska pärlor? Hur väljer man?
Begär gratis prov och lägre pris för bulkköp
1. DNA-pärlor
2. Introduktion av stjärn-DNA-pärlor
3. RNA-reningspärlor
4. mRNA-berikade magnetiska pärlor
5. Yeasen magnetiska pärlor produktrekommendation
1. DNA Pärlor
1.1 Grundläggande principer
Principen för rening av nukleinsyra med magnetiska pärlor är baserad på fastfas reversibel immobilisering (SPRI). Under vissa förhållanden är nukleinsyran selektivt bunden till de magnetiska pärlorna, medan föroreningar finns kvar i lösningen. Efter applicering av ett magnetfält separeras de magnetiska pärlorna som binder med målmolekylerna från lösningen, och sedan rengörs de magnetiska pärlorna för att ytterligare avlägsna föroreningar. Eftersom kombinationen av magnetiska pärlor och nukleinsyramolekyler är reversibel, kan nukleinsyran elueras från de magnetiska pärlorna med en buffert med låg salthalt.
Den yttre ytan av magnetiska pärlor är modifierad med funktionella kiselhydroxyl- eller karboxylgrupper. I reningsbuffertsystemet som innehåller PEG och högsaltjoner binds DNA med pärlor genom att bilda en jonbrygga av DNA-saltjonkarboxylgrupp. Denna bindning är reversibel. Jonbryggan avlägsnas i TE-bufferten utan PEG och saltjoner, och slutligen renas DNA. Baserat på karboxylmagnetiska pärlor, kommer olika magnetiska pärlingångar och reningsbuffertar att binda olika fragmentstorlekar. De magnetiska pärlorna binder företrädesvis stora fragment av DNA, så i den första omgången används magnetiska pärlor för att binda fragmenten som är större än målfragmentet, och supernatanten behålls; I den andra omgången binder de magnetiska pärlorna målfragmentet i supernatanten och kasserar sedan supernatanten; Slutligen elueras målfragmentet från de magnetiska pärlorna, vilka DNA-fragmenten har målstorleken.
Bild 1. Karboxylmagnetisk pärlstruktur
Figur 2. Principen för DNA-rening magnetiska pärlor
1.2 Driftprocess
Figur 3. DNA-reningssteg
Figur 4. Steg för urval av DNA-storlek
1.3 Tips för att använda magnetiska pärlor
Förbättrad avkastning och exakt storleksval
(1) Blanda väl före användning och balansera de magnetiska pärlorna till rumstemperatur i minst 30 min.
—— Lösligheten av PEG i de magnetiska pärlorna buffert påverkas lätt av pH och temperatur.Före användning är det nödvändigt att jämvikta till rumstemperatur för att göra de magnetiska pärlorna jämnt suspenderade och PEG helt upplösta för att undvika att påverka adsorptions- och separationseffekterna
(2) Adsorptionstiden bör vara tillräcklig och helt blandad att göra adsorptionen adekvat;
(3) Tvätta med 80 % etanol under rening eller separation;
——Under 80 % etanol är nukleinsyran dehydrerad och samlad tätt och kommer inte att lösas upp. Resterande enzymer, buffertar, föroreningar etc. i systemet rengörs med etanol för att få en renare bibliotek.
(4) Under val av storlek, bekräfta provvolymen för att säkerställa att tillsatsförhållandet för magnetiska pärlor är korrekt;
——Under storleksval är det nödvändigt att noggrant mata in motsvarande volym av magnetiska pärlor, så att proportionen är korrekt, eftersom förändringen av PEG och saltjonkoncentrationen i bufferten kan påverka resultaten.
(5) Innan elueringssteget, låt alkoholen förångas helt, men hindra pärlorna från övertorkning
——I allmänhet kan den torkas på 2~3min. När antalet magnetiska pärlor är stort och svårt att torka, Det rekommenderas att arbeta i flera centrifugrör.
(6) Om de magnetiska pärlorna är agglomererade eller skivade, elueringstiden kan förlängas efter fullständig blandning;
——Det kan bero på föroreningar i DNA eller för lång torktid. I allmänhet, när det finns många föroreningar i DNA, rekommenderas det att rena det först före storleksval.
2. Star DNA-pärlor introduktion
Hieff NGS™ DNA-selektionspärlor är baserade på principen om SPRI (fastfas omvänd immobilisering), med hjälp av importerade råmaterial för magnetiska pärlor och ett optimerat buffertsystem, som kan användas för urval av DNA-fragmentstorlek och rening under konstruktionen av NGS-biblioteket. Det används på samma sätt som de använda AMPure XP-pärlorna, och effektiviteten för fragmentåterställningen och bibliotekets storleksfördelning är mycket överensstämmande med dem.
2.1 Införande av reningsprestanda
- Unikt buffertsystem: DNA-fragment ner till 50 bp kan återställas.
- Hög återvinningsgrad: ≥90%.
- Ta bort föroreningar effektivt: Ta effektivt bort orenheter som primerdimer, dNTP, oorganiskt salt och protein.
- Brett användningsområde: Lämplig för DNA-rening i sådana scenarier som enzymklyvning, ligering, kloning och NGS-biblioteksuppbyggnad.
Tabell 1. DNA-rening och återvinningseffektivitet av magnetiska pärlor med olika förhållanden
| Erfarenhetsgrupp | Återvinningskoncentration av magnetiska pärlor i denna sats (ng/μL) | Återvinningsgrad | AMPure XP beads Group (ng/μl) ④ | Återvinningsgrad | CV % | |||
| Förhållande | ① | ② | ③ | Genomsnitt | ||||
| 1,8× | 22.2 | 23.4 | 22.8 | 22.8 | 96,92 % | 22.2 | 94,37 % | 2,55 % |
| 0,8× | 20.2 | 19.3 | 18.5 | 19.33 | 82,19 % | 17.8 | 75,67 % | 6,52 % |
| 0,6× | 16.3 | 17.3 | 16.8 | 16.8 | 71,42 % | 16.2 | 68,87 % | 2,55 % |
Figur 5. Reningseffekt av magnetiska pärlor resulterar i agarosgelelektrofores
M：1kb DNA-stege;
2.2 Storleksvalsprestanda
- Lätt till fungera: separationsprincipen och experimentell drift är helt förenliga med XP magnetiska pärlor
- Exakt storleksval: storleken på sorterade fragment är korrekt och stabil
- Bred användbarhet: lämplig för byggnad DNA- och RNA-bibliotek och anpassning att fragmentera storleksval av olika provtyper
- Ultrahög kostnadsprestanda: stabil kvalitet, mer ekonomiskt pris, mer hänsynsfull för- och eftermarknadsservice
Figur 6. Resultat för urval av DNA-storlek
3. RNA-reningspärlor
Hieff NGS™ RNA-rengörare är baserad på SPRI-principen, som effektivt kan avlägsna proteiner, saltjoner och andra föroreningar för att erhålla koncentrerade RNA-prover med hög renhet, och noggrant optimera det sura buffertsystemet för att bibehålla stabiliteten i RNA-strukturen och förhindra RNA-nedbrytning. Det är lämpligt för RNA-bibliotekskonstruktion, rening av totala RNA-prover efter rRNA-borttagning, rening av RNA-produkter transkriberade in vitro, rening av RNA-märkta produkter, rening av syntetiskt RNA, etc.
- Hög kvalitet: importerade råvaror, mycket stabil kvalitet
- Optimerat buffertsystem: säkerställ renheten och integriteten hos RNA och förhindra effektivt RNA-nedbrytning
- Hög effektivitet: effektiv återhämtning, lämplig för RNA-bibliotekskonstruktion eller in vitro återställning av transkriptionsprodukter etc.
Figur 7. Elektroforetogram av olika prover efter rening
4. mRNA-berikade magnetiska pärlor
4.1 Principen för mRNA-isolering
mRNA-separation och anrikning magnetiska pärlor är magnetiska pärlor som ytmodifieras med oligo (dT). Genom hybridiseringsprincipen kan de specifikt binda mRNA med Poly A-svans och specifikt separera mRNA från totalt RNA eller vävnadsceller. Detta kit med den optimerade produktformeln kan effektivt isolera högrent komplett mRNA från RNA från celler och vävnader från djur, växter, insekter och eukaryota mikroorganismer.
Bild 8.principen för anrikning och rening av mRNA-magnetiska pärlor
4.2 mRNA isolering pärlor prestanda
Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit är oberoende utvecklat av Yeasen för isolering av mRNA från totalt RNA. mRNA-infångningskulorna är paramagnetiska mikrosfärer i mikronstorlek modifierade med oligo (dT). Genom att kombinera med mRNA med poly (A) svans, isoleras mRNA och renas från 10 ng-4 μg totalt RNA med god integritet.
- Hög effektivitet: mRNA-rening kan slutföras inom 45 minuter
- Hög renhet: oligo (dT) magnetiska pärlor binder specifikt mRNA
- Pålitlig: det erhållna mRNA:t är lämpligt för NGS, in vitro translation, RT-PCR och cDNA-syntes
Figur 9. mRNA-isoleringskit-rening av mRNA från olika RNA-prover
Obs: hushållningsgenutbytet representerar effekten av mRNA-återvinning. rRNA-relaterat genutbyte karakterisering rRNA-avlägsnande effektivitet
4.3 Vanliga frågor om mRNA magnetiska pärlor
(1) Varför agglomererar magnetiska pärlor och hur löser man det?
——Magnetiska pärlor agglomeration kommer att minska utbytet och renheten av mRNA. Provet kan innehålla många föroreningar, såsom polysackarider, proteiner och långkedjigt DNA. Dessa föroreningar kommer att leda till magnetiska pärlor agglomerering. Lösningen är att blåsa de magnetiska pärlorna genom en pipett. Genomiskt DNA kan avlägsnas genom DNas-behandling före rening. Om den initiala provstorleken är för stor och överstiger belastningen av de magnetiska pärlorna, kommer de magnetiska pärlorna att agglomerera också. Det rekommenderas att arbeta enligt inmatningsmängden i manualen.
(2) Varför är mRNA-utbytet lågt?
——Det finns många anledningar till lågt mRNA-utbyte:
- mRNA-expressionsnivån för celler eller vävnader är låg, så vi kan välja lämpliga uttrycksperiodprover eller på lämpligt sätt öka provets totala RNA-inmatningsmängd.
- Förhållandet mellan magnetiska pärlor och prover är för lågt, vilket påverkar kombinationen av mRNA och magnetiska pärlor. Försök att öka antalet magnetiska pärlor eller minska provinmatningsmängden och -volymen.
- Hybridiseringstiden är för kort, inkubationstiden kan ökas till 10-15 min;
- Elueringen är otillräcklig, det är nödvändigt att på lämpligt sätt öka volymen av elueringsbufferten, öka elueringstiden och temperaturen eller upprepa elueringssteget två gånger.
(3) Hur eliminerar man effektivt rRNA?
——Om operationen är felaktig kommer rRNA:t att vara ospecifikt bundet till de magnetiska pärlorna tillsammans med mRNA:t under reningen, speciellt när det finns en stor mängd total RNA-inmatning. Två omgångar av bindning används vanligtvis i reningsprocessen för att effektivt undvika rRNA-förorening. Se till att det är helt blandat under tvättexperimentet för att ta bort den ospecifika bindningen och försök att ta bort rRNA-föroreningar.
(4) För många nedströmsapplikationer, är det nödvändigt att eluera mRNA, och kommer magnetiska pärlor att störa nedströms enzymreaktioner?
——Vissa nedströmsreaktioner kan utföras direkt med magnetiska pärlor utan att eluera mRNA, såsom mRNA-fragmentering och omvänd transkription i RNA-biblioteksbyggnad.Men om PCR-reaktioner ska utföras är det nödvändigt att säkerställa att det inte finns någon genomisk DNA-förorening, annars kommer många genomiska amplifieringsfragment att genereras, vilket kommer att störa de experimentella resultaten. Detaljerade operationer kan utföras enligt instruktionerna för motsvarande nedströmsreaktioner, såsom RNA-Seq-bibliotekskonstruktion
(5) Kan kitet separera mRNA direkt från celler eller vävnader?
——Rekommenderas inte! Lysatet innehåller några komponenter som kommer att påverka bindningen av mRNA. Det rekommenderas att använda ett speciellt kit.
5. Yeasen magnetiska pärlor produktrekommendation
Hieff NGS™-seriens magnetiska pärlor som Yeasen stjärnprodukter har utmärkt prestanda och hög produktionskapacitet för att möta olika applikationer, och ersätter sömlöst Beckman AMPure XP-pärlor. Sedan lanseringen 2018 har Yeasen magnetiska pärlor vunnit ett gott rykte i branschen och försäljningen har fortsatt att öka. De är det bästa valet för bra kvalitet och lågt pris.
Tabell 2. Yeasen magnetiska pärlor produktrekommendation
| Produktnamn | Katt# | Specifikation | Användnings- och tillämpningsscenarier |
| Hieff NGS™ DNA-selektionspärlor | 12601ES03 | 1 ml | 👉NGS DNA rening och storleksval 👉PCR-produktrening 👉Rening av enzymnedbrytnings- och ligeringsprodukter |
| 12601ES08 | 5 ml | ||
| 12601ES56 | 60 ml | ||
| 12601ES75 | 450 ml | ||
| Hieff NGS™ RNA Cleaner | 12602ES03 | 1 ml | 👉RNA-rening 👉Rening av totala RNA-prover efter rRNA-borttagning 👉Rening av RNA-märkta produkter |
| 12602ES08 | 5 ml | ||
| 12602ES56 | 60 ml | ||
| 12602ES75 | 450 ml | ||
| Hieff NGS™ mRNA Isolation Master Kit | 12603ES24 | 24 T | 👉mRNA-isolering och rening 👉In vitro-transkriptions-mRNA-rening |
| 12603ES96 | 96 T |
Angående läsning
Om NGS-relaterad teknik, hur mycket vet du?
5 minuter för att förstå det förflutna och nuet av DNA-selektionspärlor (inklusive resultatanalys och tolkning av FAQ)