Apoptozise Giriş
Apoptozis, bir hücrenin gelişimi sırasında veya belirli faktörlerden etkilendiğinde meydana gelen ve hücre içi genlerin ve ürünlerinin düzenlenmesiyle tetiklenen programlanmış bir hücre ölümü fenomenidir. Apoptozis yolunda, olaylar kronolojik bir sırayla, birer birer meydana gelir ve apoptotik veziküllerin ortaya çıkmasına yol açar ve ardından apoptozis meydana gelir. Apoptozis, embriyonik gelişim ve morfogenezde, dokularda stabil bir normal hücre popülasyonunun korunmasında, vücudun savunma ve bağışıklık tepkilerinde, hastalık veya zehirlenmenin neden olduğu hücresel hasarda, yaşlanmada ve tümörlerin gelişiminde önemli bir rol oynar ve potansiyel terapötik değere sahiptir.
Algılama İlkesi
Fosfolipitlerin normal hücre zarlarındaki dağılımı asimetriktir. Fosfatidilserin (PS) canlı hücrelerde hücre zarının iç yüzeyinde bulunur ve apoptoz sırasında hücre zarı bir değişime uğrar ve PS hücre zarının iç yüzeyinden hücre zarının dış yüzeyine çevrilir. Annexin V, apoptotik hücrelerin yüzeyindeki PS'yi özel olarak tanırken, canlı hücrelerdeki PS hücre zarının iç yüzeyinde bulunur ve Annexin V'ye özel olarak bağlanamaz.
Nekrotik hücrelerin PS'si de hücre zarının iç yüzeyinden hücre zarının dış yüzeyine döner ve Annexin V de nekrotik hücrelerin yüzeyindeki PS'yi tanır, bu nedenle Annexin V nekrotik ve apoptotik hücreler arasında ayrım yapamaz. Buna karşılık, PI boyası hücre içi DNA'ya bağlanabildi ve nekrotik hücreler ile canlı hücreler arasında ayrım yapabildi. Erken apoptotik hücrelerin ve canlı hücrelerin hücre zarı hala sağlamdır ve PI boyası hücre zarından serbestçe geçip hücreye giremez ve DNA'ya bağlanamaz, bu nedenle PI boyası apoptotik hücreleri ve canlı hücreleri etiketleyemezken, PI boyası nekrotik hücrelerin hücre zarından geçebilir ve hücre içindeki DNA'ya bağlanabilir ve nekrotik hücrelerdeki PI boyası, ilgili kanal tarafından alınacak olan 488 nm lazer tarafından uyarıldıktan sonra kırmızı floresans yayacaktır. Bu sayede Annexin V ve PI canlı hücreler, erken apoptotik hücreler ve geç apoptotik veya nekrotik hücreler arasında ayrım yapmak için eş zamanlı olarak kullanılabilir.
Şekil 2 Annexin V / PI tespitinin prensibi
Akış Sitometrisi Tespiti
FITC'nin maksimum uyarılma dalga boyu 488 nm, maksimum emisyon dalga boyu 525 nm'dir ve FITC'nin yeşil floresansı FL1 kanalında tespit edilir. PI-DNA kompleksinin maksimum uyarım dalga boyu 535 nm, maksimum emisyon dalga boyu 615 nm'dir ve PI'nin kırmızı floresansı FL2 veya FL3 kanalında tespit edilir. Analiz CellQuest gibi yazılımlarla gerçekleştirildi ve FITC'nin yatay koordinat ve PI'nin dikey koordinat olduğu iki renkli bir saçılma grafiği çizildi. Tipik deneylerde hücreler üç alt popülasyona ayrılabilir; canlı hücreler yalnızca çok düşük yoğunluklu arka plan floresansına, erken apoptotik hücreler yalnızca güçlü yeşil floresansa ve geç apoptotik hücreler yeşil ve kırmızı floresanla çift boyamaya sahiptir.
Şekil 3 Akış Sitometrisi Tespiti
Sıkça Sorulan Sorular
S: Annexin V apoptozis testi bitkilere veya bakterilere (prokaryotlar) uygulanabilir mi?
A: Evet, ancak bitki hücreleri veya bakteriler (prokaryotlar) hücre duvarları içerdiğinden protoplast hazırlamak gerekir. Boyama solüsyonunun belirli dozajı yalnızca hücreleri daldırmak için yeterlidir ve boyama süresi farklı hücreler için biraz farklıdır.
S: Deneyin sonucunu nasıl değerlendirebiliriz?
A: Canlı hücreler (Annexin V-/PI-), erken apoptotik hücreler (Annexin V+/PI-), geç apoptotik hücreler ve nekrotik hücreler çift pozitiflik (Annexin V+/PI+), çıplak çekirdekler (Annexin V-/PI+) göstermektedir.
S: Annexin V ile TUNEL arasındaki fark nedir?
A: Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP çentik uç etiketleme (TUNEL), geç apoptozisin ayırt edici bir özelliği olan hücre içi DNA parçalanma bölgelerini tanımlamak için kullanılan bir boyama yöntemidir.
Annexin V boyama, hücre zarı asimetrisinin kaybı nedeniyle hücre dışında açığa çıkan PS kalıntılarına bağlanarak apoptozun erken evrelerini tanır.
S: PI saptanmadan sadece Annexin V-FITC kullanılarak testin yapılması mümkün müdür?
A: Evet, mümkündür. Çekirdeksiz kırmızı kan hücreleri veya PI tespitine müdahale eden Doksorubisin (Adriamisin) ilacının kullanımı gibi özel test örnekleri için, her iki durumda da yalnızca Annexin V-FITC kullanılarak testin gerçekleştirilmesi mümkündür.
Ürün Detayları
| Ürün Adı | Ürün No. | Şartname |
| Annexin V-FITC/7-AAD Apoptozis Tespit Kiti | 40311ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40302ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-PE/7-AAD Apoptozis Tespit Kiti | 40310ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40303ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-YSFluor™ 488/7-AAD Apoptozis Tespit Kiti | 40313ES60 | 100T |
| 40305ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40304ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| Annexin V-YSFluor™ 647/7-AAD Apoptozis Tespit Kiti | 40312ES20/50/60 | 20T/50T/100T |
| 40306ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40307ES20/50/60 | 20T/50T/100T | |
| 40308ES20/50/60 | 20T/50T/100T |