Son yıllarda, biyomedikalin hızla gelişmesi, COVID-19 pandemisi altında hücre ve gen terapilerinin ortaya çıkması ve mRNA aşılarının ortaya çıkmasıyla, biyolojik ürünlerin güvenliğini ve güvenilirliğini sağlamak dünya çapındaki hükümetler ve düzenleyici kurumlar için odak noktası haline geldi. Mikoplazma kontaminasyonu yaygın ancak ortadan kaldırılması genellikle zor bir kontaminasyon türüdür. Düzenleyici gereklilikler, hücre kültürü içeren biyoprosesler için "mikoplazma kontaminasyonunun olmamasını sağlamayı" zorunlu kılar.
Düzenleyici Kurumların Mikoplazma Testlerine İlişkin Gereksinimleri:
- FDA'nın "Sanayi İçin Rehber: Bulaşıcı Hastalık Endikasyonları İçin Viral Aşı Üretiminde Kullanılan Hücre Substratlarının ve Diğer Biyolojik Materyallerin Karakterizasyonu ve Niteliği" adlı kılavuzu, ham maddeler, viral tohumlar ve işlenmemiş hasat sıvıları için mikoplazma kontrolünü şart koşmaktadır.
- Çin Farmakopesi'nin 2020 baskısı Bölüm III "Biyolojik Ürün Üretim Testleri İçin Kullanılan Hayvan Hücre Substratlarının Hazırlanması ve Kalite Kontrolü", Ana Hücre Bankaları (MCB), Çalışma Hücre Bankaları (WCB) ve Üretim Sonu Hücreleri (EOPC) dahil olmak üzere üretim hücreleri için mikoplazma testi yapılmasını zorunlu kılıyor.
- "İmmün Hücre Terapi Ürünlerinin Farmasötik Araştırma ve Değerlendirmesi İçin Teknik Kılavuzlar (Deneme)", uygun ara örneklerde önemli zaman noktalarında mikoplazma güvenliğiyle ilgili testler yapılmasını veya kontrol için ilgili önlemlerin uygulanmasını önermektedir. Mikoplazma testi, nihai ürünler için bir serbest bırakma testi olarak da gereklidir.
Nükleik Asit Testi (NAT) ve Geleneksel Yöntemler:
Nükleik Asit Amplifikasyon Teknolojisi (NAT) gibi hızlı tespit yöntemlerinin ortaya çıkmasından önce, geleneksel kültür yöntemleri ve gösterge hücre analizleri kullanılıyordu. Ancak, uzun tespit döngüleri veya hassasiyet sorunları nedeniyle, bu yöntemler genellikle üretim veya salım döngülerini uzattı veya risk değerlendirmesine veya alternatif yöntemlerin araştırılmasına dayalı olarak hücre materyallerinin koşullu salımını gerektirdi. Hücre ve gen terapilerinin ilerlemesiyle, endüstride daha yüksek zamanında ve hassasiyete sahip mikoplazma tespit yöntemlerine olan talep artmaktadır. Ürünlerin kısa raf ömrü, uzun test sürelerini karşılayamaz, bu nedenle NAT yöntemleri uygun alternatifler olarak ortaya çıkmıştır.
Şu anda, Avrupa Farmakopesi (EP) <2.6.7>, Japon Farmakopesi (JP) ve Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP) <63>, NAT yöntemlerini mikoplazma tespit yöntemleri olarak dahil etmiştir. Ancak, bu yöntemin doğrulanması ve duyarlılığının daha düşük olmadığından emin olmak için geleneksel yöntemlerle karşılaştırılması, kullanımı için ön koşullardır. Çin Farmakopesi'nin (ChP) 2020 baskısı, NAT'ı bir mikoplazma tespit yöntemi olarak dahil etmemiş olsa da, "ulusal ilaç düzenleyici otoritesi tarafından tanınan diğer yöntemlerin" kullanılması olasılığından bahsetmektedir. Mayıs 2022'de, Ulusal Tıbbi Ürünler İdaresi'nin (NMPA) İlaç İnceleme Merkezi, örnek hacmi sınırlı olduğunda veya hızlı salım gerektiğinde ve farmakope yöntemleri yetersiz olduğunda özel koşullar altında salım testi için yeni steril ve mikoplazma tespit yöntemlerinin geliştirilmesini öneren "İlaç Araştırması ve Bağışıklık Hücre Terapi Ürünlerinin Değerlendirilmesine Yönelik Teknik Kılavuzlar (Deneme)"ni yayınladı. Bu nedenle, NAT yöntemlerinin, hızlı mikoplazma salınım testini destekleyebilen bir yöntem olarak giderek daha fazla hammadde tedarikçisi ve İleri Terapi Tıbbi Ürün (ATMP) şirketi tarafından kullanılması beklenmektedir.
NAT Yöntemi - Yöntem Doğrulama Gereksinimleri
NAT yöntemlerinin validasyon süreci Avrupa Farmakopesi <2.6'da ayrıntılı olarak açıklanmıştır.7> ve Japon Farmakopesi, içerikleri esasen tutarlıdır. Ulusal Gıda ve İlaç Kontrol Enstitüleri (NIFDC) ayrıca Çin'deki mikoplazma nükleik asit amplifikasyon yöntemlerinin geliştiricileri ve kullanıcıları için rehberlik sağlamayı amaçlayan "Nükleik Asit Tespit Yöntemleri ve Mikoplazma İncelemesi için Metodolojik Doğrulama Üzerine Düşünceler" başlıklı bir makale yayınladı. Spesifiklik, Tespit Sınırı ve Sağlamlık, mikoplazma NAT yöntemlerini doğrulamak için esastır. Mikoplazma tespiti için ticari kitler kullanılıyorsa, yöntem uygunluk doğrulaması, tedarikçinin kapsamlı kit performans raporuna, laboratuvar ortamı ve örnek türüyle birleştirilerek yapılabilir.
Özgüllük:
Özgüllük, bir analitik yöntemin analiti diğer bileşenlerin (safsızlıklar, bozunma ürünleri, yardımcı maddeler vb.) varlığında doğru bir şekilde belirleme yeteneğini ifade eder. EP, filogenetik ağaçla yakından ilişkili olan diğer bakteri türleri arasındaki çapraz reaksiyonlara odaklanma ihtiyacını vurgular, örneğin Gram pozitif bakteriler içindeki Clostridium, Lactobacillus ve Streptococcus. Ayrıca, konak hücrelerdeki ve deneysel ortamlardaki insan DNA kontaminasyonu gibi yaygın kontaminant türlerine de dikkat edilmelidir.
Tespit Sınırı:
Tespit limiti, bir numunede tespit edilebilen en düşük analit miktarıdır. Nitel bir tanımlama temeli olarak hizmet eder ve kesin bir değer olarak niceliklendirilmesi gerekmez. EP, her seyreltme konsantrasyonunda her mikoplazma türü için 24 tespit veri noktası gerektirir. Bu, her seyreltme gradyanı için sekiz tekrarlı tespitle farklı günlerde üç bağımsız 10 katlı seri seyreltme gerçekleştirerek veya her seyreltme gradyanı için altı tekrarlı tespitle farklı günlerde dört bağımsız 10 katlı seri seyreltme gerçekleştirerek elde edilebilir. %95'in üzerinde bir tespit pozitifliği oranı tespit limiti olarak düşünülebilir. Tespit limitinin doğrulanmasını gerektiren mikoplazma tipleri için, kit üreticilerinin düzenleyici farmakopelerin gerektirdiği şekilde mümkün olduğunca çok sayıda mikoplazma tipini kapsaması ve her mikoplazma tipi için tespit limitlerini araştırması gerekir. Biyofarmasötik şirketler için insan mikoplazma tiplerini de dikkate almaları önerilir.
- Üretim sürecinde kuş hücreleri veya materyallerinin kullanılması veya bunlara rastlanması durumunda Mycoplasma synoviae için tespit limiti doğrulaması yapılmalıdır.
- Üretim sürecinde böcek veya bitki materyallerinin kullanılması veya bunlarla karşılaşılması durumunda Acholeplasma için tespit limiti doğrulaması yapılmalıdır.
- Domuz burun mikoplazması, mikoplazma ile kontamine olmuş örneklerde oldukça yaygındır ve Çin Gıda ve İlaç Kontrol Enstitüsü'nün dikkatini çekmiştir.
Avrupa Farmakopesi ile karşılaştırıldığında Japon Farmakopesi, tespit limiti doğrulamasının gerekli olduğu kuş mikoplazmasından bahsetmezken, tükürük mikoplazmasını içerir.
Sağlamlık:
Sağlamlık, bir yöntemin ölçüm koşullarındaki küçük değişikliklere etkilenmeden dayanma yeteneğini ifade eder ve yerleşik yöntemin rutin testlerde kullanılması için bir temel sağlar. Sağlamlığın değerlendirilmesi, mikoplazma tespit yöntemlerinin tespit reaktiflerindeki MgCl2, primerler ve dNTP'lerin konsantrasyonundaki değişikliklere, nükleik asit çıkarma kitlerindeki veya çıkarma adımlarındaki değişikliklere ve farklı nükleik asit amplifikatörlerinin kullanımına olan toleransına odaklanmalıdır.
Karşılaştırılabilirlik Çalışması
NAT'ın farmakope yöntemlerine ikame olarak kullanılması durumunda, NAT'ın kültür bazlı yöntemlerin veya indikatör hücre kültürü yöntemlerinin yerini alabileceğinin karşılaştırma yoluyla teyit edilmesi gerekir.Bu, genellikle yöntemin tespit limitinin yanı sıra özgüllüğünün (mikoplazma kapsamının aralığı ve olası yanlış pozitifler gibi) dikkate alınmasını içerir. Tespit limitlerini karşılaştırmak için, "10 CFU/mL'lik bir tespit limiti kültür tabanlı yöntemlerin yerini alabilir ve 100 CFU/mL'lik bir tespit limiti gösterge hücre kültürü yöntemlerinin yerini alabilir" kriterini karşılamalıdır.
Karşılaştırılabilirlik çalışmalarını yürütmek için iki isteğe bağlı yaklaşım vardır:
- Tespit limitini doğrulamak amacıyla hem NAT hem de farmakope yöntemleri için aynı doğrulanmış mikoplazma suşlarını kullanarak eşzamanlı deneyler yürütmek.
- NAT validasyon sonuçlarının daha önceki farmakope yöntem validasyon sonuçlarıyla karşılaştırılması, ancak her iki yöntemde kullanılan mikoplazma standartlarına ait onay dosyalarının dikkatli bir şekilde dokümante edilmesi gerekmektedir.
NAT Mycoplasma qPCR Tespiti - Kapsamlı Çözüm
İlgili Ürünler
Yeasen MycAway™ Mycoplasma qPCR Test Kiti (prob yöntemi), ham maddelerde, hücre bankalarında, viral tohumlarda, virüs veya hücre hasat sıvılarında ve terapötik hücrelerde olası mikoplazma kontaminasyonu için NAT'a (nükleik asit amplifikasyon teknikleri) dayalı hızlı bir nitel tespit ürünüdür. Kantitatif PCR teknolojisine dayalı bu kit, test örneğindeki mikoplazma DNA'sını nitel olarak tespit etmek için Taqman floresan problarını kullanır ve 160'tan fazla mikoplazma DNA dizisini kapsar. Mikoplazma tespiti için EP 2.6.7 ve JP G3'ün yönergelerini ve gereksinimlerini sıkı bir şekilde takip ederek yüksek hassasiyet, iyi özgüllük ve güvenlik gösterir. Numuneleri manuel olarak çıkarmak veya Auto-Pure 32A Tam Otomatik Nükleik Asit Çıkarıcıyı kullanarak nükleik asitleri otomatik olarak çıkarmak için MolPure® Manyetik Boncuk Kalıntı DNA Numune Ön İşlem Kiti ile birlikte kullanılabilir. Örnek ön işlemi uygulanarak karışan safsızlıklar giderilip saflaştırılmış mikoplazma DNA'sı elde edildikten sonra, tespit sonucunu belirlemek için probun floresan sinyali qPCR ile toplanır.
Teknik Hizmetler
- MycAway™ Mycoplasma qPCR Test Kiti için kapsamlı doğrulama raporları sağlıyoruz.
- Müşteri numunelerinin uygulanabilirliğinin doğrulanması için teknik hizmetler sağlanması.
- Denetim desteği sağlanması.
| Tanım | Parça Numarası |
| 18461ES | |
| MycAway™ Mikoplazma qPCR Tespit Kiti (2G) | 40619ES |