Bệnh tiểu đường (DM), một bệnh chuyển hóa mãn tính toàn thân đặc trưng bởi lượng đường trong máu tăng cao mãn tính do sự kết hợp của nhiều yếu tố bệnh, là một đại dịch sức khỏe toàn cầu và liên quan đến di truyền gia đình, các yếu tố môi trường, và tự miễn dịch. Mặc dù DM đã được biết đến trong nhiều thiên niên kỷ và đã đạt được những tiến bộ lớn trong chẩn đoán và quản lý, nhưng hiện tại vẫn chưa có cách chữa khỏi căn bệnh này và hậu quả của nó đối với sức khỏe cộng đồng chỉ ngày càng gia tăng. Do đó, việc thiết lập một mô hình động vật DM phù hợp và làm rõ cơ chế sinh bệnh của DM và các biến chứng của nó là đặc biệt quan trọng. Các mô hình động vật DM thường được sử dụng là cắt bỏ tuyến tụy bằng phẫu thuật, bệnh tiểu đường do hóa chất gây ra, mô hình động vật tiểu đường tự phát và động vật chuyển gen, v.v.
Hiện nay, mô hình bệnh tiểu đường được gây ra bởi Thuốc Streptozocin (STZ) được sử dụng rộng rãi, thích hợp cho việc quan sát lâu dài. STZ là một hợp chất nitrosourea, khi vào cơ thể, có thể phá hủy đặc hiệu các tế bào β tuyến tụy thông qua các cơ chế sau:
(1) Tiêm STZ liều cao có thể làm giảm nồng độ coenzyme I nội bào (NAD) ở tế bào β, do đó ức chế quá trình chuyển hóa năng lượng và protein phụ thuộc NAD, dẫn đến chết tế bào;
(2) STZ làm tăng oxit nitric (NO) sản xuất, đã được chứng minh là có liên quan đến tổn thương tế bào β;
(3) Được sử dụng ở liều thấp, STZ có thể kích hoạt quá trình tự miễn dịch dẫn đến phá hủy các tế bào β của các đảo tụy: các tế bào β chết, do liều thấp của STZ, có thể được thực bào bởi các đại thực bào như các kháng nguyên để sản xuất yếu tố kích thích Th1, làm cho các tế bào lympho loại Th1 chiếm ưu thế. Sau đó, các tế bào lympho loại Th1 sản xuất IL-2 và IFN- γ, gây ra sự thâm nhiễm của các tế bào viêm trong đảo tụy và giải phóng IL-1 và TNF- α, IFN- γ, NO và H2Ồ2 để tiêu diệt tế bào, cuối cùng gây ra bệnh DM.
1 SOP chuẩn để xây dựng mô hình bệnh tiểu đường do STZ gây ra
1.1 Chuẩn bị động vật
Có sự dị hình giới tính rõ rệt và con đực dễ mắc bệnh tiểu đường hơn. Vì estrogen can thiệp vào hoạt động của STZ, nên động vật cái ít nhạy cảm hơn với hoạt động gây tiểu đường của STZ so với con đực. Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng con cái có tỷ lệ mô hình hóa kém và tỷ lệ tử vong cao hơn con đực, đặc biệt là loại I.
Bệnh tiểu đường loại I (T1DM): Chuột (170-200 g) và chuột (17-22 g) được khuyến cáo. Sau một tuần cho ăn thích nghi, cho động vật nhịn ăn trong 12 giờ sau đó tiêm STZ vào phúc mạc, có thể thực hiện dễ dàng và có tỷ lệ thành công cao.
Bệnh tiểu đường loại II (T2DM): Chuột (tuổi 4-5 tuần, nặng 90-100 g, ví dụ SD hoặc Wistar) và chuột nhắt (tuổi 4-5 tuần, nặng 16-20 g, ví dụ C57, ICR hoặc Kunming) nên được cho ăn chế độ ăn nhiều chất béo và nhiều đường trong 4-6 tuần trước khi dùng STZ, và trọng lượng cơ thể có thể đạt được riêng lẻ khoảng 240-280g và 30-35g. SD được khuyến nghị cho chuột cống và C57 cho chuột nhắt.
1.2 Thức ăn cho vật nuôi trước khi dùng STZ
Tiểu đường týp 1: Cho phép tất cả chuột nhắt hoặc chuột cống được tiếp cận tự do với chế độ ăn và nước tiêu chuẩn dành cho loài gặm nhấm trong 1-2 tuần với chế độ ăn thích nghi trước khi điều trị bằng STZ.
Bệnh tiểu đường týp 2: Tiêu thụ chế độ ăn nhiều chất béo và nhiều đường để gây kháng insulin trước khi điều trị bằng STZ.
1.3 Chuẩn bị thuốc thử
① Chế độ ăn nhiều chất béo và nhiều đường
Chế độ ăn nhiều chất béo và nhiều đường được tạo ra bằng cách trộn thức ăn cơ bản cho chuột với đường sucrose, mỡ lợn tinh chế và bột lòng đỏ trứng theo tỷ lệ khối lượng: tỷ lệ là 10% mỡ lợn, 20% đường sucrose, 10% bột lòng đỏ trứng, 0,5% natri cholate và 59,5% thức ăn cơ bản.
② STZ-đệm natri citrat
Chuẩn bị dung dịch A và dung dịch B: Cân 2,1 g axit citric (MW: 210,14) và hòa tan trong 100 mL nước cất hai lần để tạo thành dung dịch A; cân 2,94 g natri citrat (MW: 294,10) và hòa tan trong 100 mL nước cất hai lần để tạo thành dung dịch B.
Chuẩn bị dung dịch đệm natri citrat: Trộn dung dịch A và B theo tỷ lệ nhất định (1:1,32 hoặc 1:1), điều chỉnh pH đến 4,2-4,5 và lọc khử trùng bằng màng lọc 0,22 μm. Điều này tạo ra dung dịch đệm natri citrat cần thiết; nên chuẩn bị và sử dụng ngay.
Cân bột đông khô STZ, cho vào lọ khô, vô trùng, bọc bằng giấy bạc và để trong đá. Thêm đệm natri citrat đã làm lạnh trước (1% w/v) để hòa tan và lọc khử trùng bằng màng lọc 0,22 μm.
【Lưu ý】① Sau khi lấy bột STZ ra khỏi tủ lạnh, để ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng trong khoảng 10 phút cho đến khi tan hoàn toàn. ② Sau khi cân, phải đậy kín lọ đựng mẫu STZ bằng giấy bạc để tránh ánh sáng vì STZ không ổn định. ③ Không được hòa tan STZ cùng một lúc nếu bạn không có kỹ năng tiêm. Nên hòa tan STZ theo nhóm theo trình độ vận hành. Chuẩn bị dung dịch STZ cho từng nhóm một lần, chẳng hạn như 10 hoặc 15 con chuột cống/chuột nhắt cho mỗi nhóm.
1.4 Tiêm STZ
Tiêm thuốc vào phúc mạc hoặc qua tĩnh mạch đuôi dựa trên trọng lượng lúc đói của động vật. So với tiêm phúc mạc, tiêm tĩnh mạch đuôi có hiệu quả sử dụng thuốc cao hơn nhưng khó khăn hơn về mặt kỹ thuật. Nếu kỹ thuật tiêm không thành thạo, hãy luân phiên giữa hai nhóm để tiêm và tiêm phải hoàn thành trong vòng 30 phút.
Tiểu đường týp 1: Đối với chuột, liều cao duy nhất được khuyến cáo là 100-200 mg/kg, và liều thấp nhiều lần là 20-50 mg/kg trong năm ngày liên tiếp; đối với chuột cống, liều khuyến cáo là 40-70 mg/kg, tiêm một lần duy nhất.
Bệnh tiểu đường týp 2:Sau khi cho chuột ăn chế độ nhiều đường và nhiều chất béo trong 1-2 tháng, liều khuyến cáo là 70-120 mg/kg, tiêm một lần duy nhất; đối với chuột cống, liều khuyến cáo là 25-40 mg/kg, tiêm một lần duy nhất.
【Lưu ý】Khuyến cáo nên tiến hành thử nghiệm trước để xác định liều lượng STZ phù hợp, do trọng lượng, khả năng dung nạp thuốc, thời gian nhịn ăn, phương pháp tiêm và quá trình cho ăn của động vật thí nghiệm khác nhau. Không nên tiến hành thử nghiệm một cách mù quáng trực tiếp theo liều lượng trong tài liệu.
1,5 Sau khi tiêm
Sau khi tiêm STZ, cho vật nuôi tự do uống nước và ăn. Thay đệm lót hàng ngày. Giữ chuồng sạch sẽ và khô ráo. Tránh ánh nắng mặt trời mạnh. Khử trùng thường xuyên nhất có thể.
【Lưu ý】Sau khi tiêm STZ, lượng đường trong máu của động vật sẽ biểu hiện ba giai đoạn: tăng đường huyết tạm thời (1-2 giờ), hạ đường huyết tạm thời (6-10 giờ) và tăng đường huyết liên tục (>72 giờ). Insulin và glucose phải được cung cấp đầy đủ.
1.6 Biện pháp khắc phục mô hình động vật
Đối với các mô hình không đáp ứng các tiêu chí, có thể dùng thêm STZ sau khi động vật đã ổn định (tiêm phúc mạc với liều 10-20 mg/kg, lựa chọn liều phù hợp dựa trên tình hình thực tế) hoặc đợi cho đến khi lượng đường trong máu trở lại bình thường rồi tiêm với liều thông thường. Tuy nhiên, để đạt được hiệu quả mong muốn, thường cần phải khởi động lại quá trình mô hình hóa sau khi trở lại trạng thái bình thường.
2 Đánh giá của STZ gây ra bệnh DM mô hình động vật
① Đặc điểm chung: sụt cân, chứng khó tiêu, chứng ăn nhiều và chứng tiểu nhiều.
② Đường huyết lúc đói (FGB), nồng độ insulin huyết thanh (FINS), dung nạp glucose đường uống (OGT), insulin huyết thanh lúc đói (FSI) và độ nhạy insulin.
③ Chỉ số sinh hóa huyết thanh: T-Cho、TG、HDL-C、LDL-C、CR、BUN、Alt, v.v.
④ Bệnh lý tuyến tụy: nhuộm H&E.
3 Những lý do có thể dẫn đến sự thất bại của mô hình DM do STZ gây ra
① Chất lượng STZ kém. Độ tinh khiết của STZ để mô hình hóa không được thấp hơn 98% (phát hiện bằng HPLC).
② Phân hủy STZ. STZ là dung dịch dễ bị ẩm, nên giữ khô, để tránh ẩm. Bột tránh để lâu ở nhiệt độ phòng và STZ hòa tan rất không ổn định, với thời gian bán hủy là pH trung tính là 15 phút và nên sử dụng tại chỗ. Vui lòng hòa tan STZ với giá trị pH có tính axit, tốt nhất là trong bồn nước đá.
③ Dung dịch STZ được tiêm vào ruột hoặc các cơ quan khác.
Nếu mô hình không đạt tiêu chuẩn DM, khuyến cáo nên theo dõi thêm 3 ngày nữa. Nếu vẫn không đạt, lặp lại quy trình tiêm.
4 Nguyên nhân gây tử vong cao ở động vật do STZ gây ra
① Động vật bị thiếu cân.
② Nguồn cung cấp nước uống không đủ.
③ Tăng đường huyết hoặc hạ đường huyết, thường là tăng đường huyết. Có thể làm giảm tình trạng này bằng cách tiêm insulin hoặc bổ sung glucose tạm thời.
Phương pháp bổ sung insulin: ví dụ, nếu dùng Novolin N hoặc NPH (insulin kẽm protamine trung tính) với liều lượng 2-3 đơn vị mỗi lần, tỷ lệ tử vong chung của chuột sẽ thấp hơn sau 3-5 ngày.
Phương pháp bổ sung glucose: Tiêm phúc mạc glucose 20% sau 4 giờ tiêm STZ có thể tránh được tình trạng chuột chết do hạ đường huyết do nhịn đói.
④ Các loài động vật thí nghiệm giết lẫn nhau vì thiếu thức ăn và nước uống.
⑤ Nhiễm trùng. Động vật DM dễ bị nhiễm trùng hơn những loài khác, đặc biệt là nhiễm trùng đường tiết niệu và nhiễm trùng bụng, do chứng đa niệu. Cần phải khử trùng trước và sau các phẫu thuật xâm lấn như tiêm phúc mạc, tiêm dưới da và lấy máu. Ví dụ, có thể bôi tetracycline (hoặc thuốc mỡ tra mắt aureomycin) vào vết thương sau mỗi lần đo đường huyết để ngăn ngừa nhiễm trùng.
5 yếu tố ảnh hưởng đến mô hình bệnh tiểu đường
Các yếu tố ảnh hưởng đến mô hình bệnh tiểu đường bao gồm chất lượng thuốc thử mô hình STZ, tình trạng của động vật và phương pháp quản lý. Các đặc điểm hiệu suất chính của thuốc thử bao gồm độ tinh khiết, độ ổn định và độ hòa tan. Tình trạng của động vật chủ yếu bao gồm nền tảng di truyền, giới tính, giới tính, cân nặng, môi trường sinh sản và cấu trúc chế độ ăn uống. Phương pháp quản lý bao gồm thời điểm quản lý, khoảng cách giữa các liều và đường dùng. Các yếu tố khác biệt mang lại hiệu ứng mô hình khác biệt.
6 Sản phẩm rkhuyến nghị
| Tên sản phẩm | Con mèo# | Đặc điểm kỹ thuật |
| 60256ES60 | 100mg | |
| 60256ES76 | 500mg | |
| 60256ES80 | 1g | |
| Axit xitric, Monohydrat | 60347ES25 | 25g |
| Muối trinatri axit xitric, Dihydrat | 60348ES25 | 25g |
| Dung môi cho Streptozocin STZ | 60750ES76 | 500mL |
[1] Xi Z, và cộng sự. Các hạt nano biến đổi kép khắc phục các rào cản hấp thụ tuần tự để cung cấp insulin qua đường uống. J Control Release. 2022 tháng 2;342:1-13. (PMID: 34864116, NẾU: 7.727)