1 Nguyên lý hoạt động của geneticomycin

Genetomycin (Geneticin, G418) là một loại kháng sinh aminoglycoside ức chế tổng hợp protein bằng cách ngăn chặn sự kéo dài chuỗi peptide bằng cách liên kết với ribosome 70S và 80S trong tế bào nhân sơ và nhân chuẩn. Cơ chế này gây độc cho các tế bào bao gồm vi khuẩn, nấm men, thực vật và động vật có vú. Khi các tế bào được chuyển gen thành công và tích hợp với gen kháng neomycin (như gen neo), aminoglycoside phosphotransferase được mã hóa bởi gen (APH (3) II) có thể sửa đổi G418 theo cách cộng hóa trị để vô hiệu hóa nó, do đó mang lại khả năng kháng cho các tế bào được nuôi trong môi trường chọn lọc có chứa G418.

Trong các xét nghiệm di truyền phân tử, G418 là một trong những xét nghiệm thường được sử dụng để chuyển gen ổn định.

2 Ứng dụng của geneomycin

2.1 Sàng lọc các dòng tế bào chuyển gen ổn định

• G418 được sử dụng để sàng lọc các tế bào chứa gen kháng (ví dụ, gen neo) bằng cách ức chế tổng hợp protein. Aminoglycoside phosphotransferase được mã hóa bởi gen kháng sẽ vô hiệu hóa G418, qua đó mang lại khả năng kháng tế bào đối với G418. Thông thường, phạm vi sàng lọc tế bào động vật có vú là 200 – 2000 μg/mL, với nồng độ làm việc thường được sử dụng nhất là 100 – 700 μg/mL. Trong đó tế bào thực vật là 10-100 μg/mL và tế bào nấm men là 500-1000 μg/mL, sau đây là nồng độ được sử dụng cho một số loại tế bào sử dụng G418 để tham khảo.

Tế bào	Ứng dụng	Nồng độ hoạt hóa của geneomycin (μg/mL)	Các tác phẩm được trích dẫn
Loài Mucor	a) Nuôi cấy trong môi trường tăng trưởng b) Nuôi cấy trên vi khuẩn đông khô	a) 10 μg/mL b) 30 μg/mL	Hirth và cộng sự, Proc. Natl. Acad. Sci., tập 79, 7356-7360 (1982).
Động vật có vú	a) Để sàng lọc b) Để duy trì tăng trưởng	a) 400 -1000 μg/mL b) 200 μg/mL	Canaani và Berg, Proc. Natl. Acad. Sci., tập 79, 5166-5170 (1982).
Thực vật	a) Để sàng lọc b) Để duy trì tăng trưởng	a) 25-50 μg/mL b) 10 μg/mL	Ursic và cộng sự, Biochem. Biophys. Res. Comm., câu 101:3, 1031-1037 (1981).
Men	a) Để sàng lọc b) Để duy trì tăng trưởng	a) 500 μg/mL b) 125-200 μg/mL	Jimenez và Davies, Thiên nhiên, câu 287, 869-871 (1980).
Vi khuẩn	Để sàng lọc	16 μg/mL	Waitz và cộng sự, Thuốc kháng khuẩn. Chất hóa học., câu 6:5, 579-581 (1974).

2.2 Gen Knockout và Chuyển gen

• Trong quá trình loại bỏ gen, G418 có thể được sử dụng để sàng lọc các tế bào loại bỏ thành công gen mục tiêu. Trong quá trình chuyển gen, G418 tạo điều kiện cho việc tích hợp các gen lạ vào bộ gen của tế bào chủ.

2.3 Lựa chọn kháng thuốc trong nuôi cấy tế bào

• Trong quá trình nuôi cấy tế bào, G418 được sử dụng để sàng lọc các tế bào kháng kháng sinh, thường mang các gen kháng thuốc cụ thể.

3 Các thủ tục thử nghiệm có liên quan đến geneomycin

3.1 Chuẩn bị dung dịch gốc G418 (50 mg/mL, Nồng độ hoạt động)

1) Chuyển đổi đơn vị hoạt động

Chuyển đổi bằng công thức: (1000/A0) × A1 = A2, trong đó A0 là hiệu lực của G418, thay đổi theo từng lô. Tham khảo báo cáo kiểm soát chất lượng cho lô tương ứng hoặc nhãn trên chai. A1 là nồng độ hoạt động mong muốn của G418 cần chuẩn bị. A2 là nồng độ bột thực tế trên thể tích cần cân.

Ví dụ, nếu lô G418 có hiệu lực là 750 U/mg và bạn muốn chuẩn bị nồng độ hoạt chất là 50 mg/mL, thì nồng độ bột thực tế cần chuẩn bị là 1000/750 × 50 mg/mL = 66,67 mg/mL.

Nếu chuẩn bị 10 mL dung dịch gốc G418 (nồng độ hoạt tính, 50 mg/mL), thì cần 666,7 mg bột.

• Khử trùng và lưu trữ

Dựa trên khối lượng bột thực tế thu được từ phép chuyển đổi trên, thêm vào 10 mL nước khử ion vô trùng để hòa tan hoàn toàn.

Đầu tiên, làm ướt trước bộ lọc xi lanh 0,22 μm bằng 5 mL nước khử ion vô trùng, loại bỏ hết nước. Sau đó, lọc bằng bộ lọc này để khử trùng và chia thành các thể tích nhỏ để sử dụng một lần (ví dụ: 1 mL) và bảo quản ở -20°C để ổn định trong 1 năm.

3.2 Thiết lập đường cong Kill

1) Ngày thứ nhất: Đặt các tế bào chưa chuyển đổi vào đĩa nuôi cấy thích hợp với mật độ tế bào 20-25% và ủ qua đêm ở 37°C, CO₂.

2) Thiết lập nồng độ gradient trong phạm vi phù hợp dựa trên loại tế bào, chọn ít nhất 6 nồng độ (G418 hoạt động mạnh nhất đối với các tế bào trong giai đoạn phân chia, do đó, nên nuôi cấy tế bào trong một thời gian trước khi thêm G418), ví dụ, đối với tế bào động vật có vú, thiết lập 0, 50, 100, 200, 400, 800, 1000 μg/mL.

3) Ngày thứ hai: Loại bỏ môi trường nuôi cấy cũ và thay thế bằng môi trường mới có chứa nồng độ thuốc tương ứng, với ba lần lặp lại cho mỗi nồng độ.

4) Thay môi trường chứa thuốc mới sau mỗi 3-4 ngày.

5) Thực hiện đếm tế bào sống theo các khoảng thời gian cố định (ví dụ, cứ 2 ngày một lần) để xác định nồng độ thích hợp ngăn ngừa sự phát triển của các tế bào chưa chuyển gen. Chọn nồng độ thấp nhất có thể tiêu diệt phần lớn các tế bào trong số ngày lý tưởng (thường là 7-10 ngày) làm nồng độ làm việc để sàng lọc dòng tế bào chuyển gen ổn định.

3.3 Sàng lọc các tế bào chuyển gen ổn định

• G418 Geneticin (60220ES) do Yisheng Biotech cung cấp có hiệu quả ≥720 U/mg, độ tinh khiết ~98% và độ ổn định theo lô, với giá chỉ bằng gần một phần ba giá sản phẩm G418 của các công ty khác.
• Môi trường sàng lọc chứa thuốc được thay thế sau mỗi 3-4 ngày.
• Sự hình thành các dòng tế bào (khuẩn lạc) được quan sát và đánh giá sau 7 ngày chọn lọc. Các khuẩn lạc có thể mất một tuần hoặc lâu hơn để hình thành, tùy thuộc vào loại tế bào chủ, quá trình chuyển gen và hiệu quả sàng lọc.
• Chọn 5-10 dòng kháng thuốc và chuyển vào đĩa nuôi cấy tế bào 35 mm, sau đó tiếp tục nuôi trong môi trường sàng lọc có chứa thuốc trong 7 ngày.
• Sau khi thay đổi môi trường nuôi cấy bình thường.

4 Khuyến nghị sản phẩm

Di truyền học G418 (60220ES) được cung cấp bởi Yeasen Biotech có hiệu quả ≥720 U/mg, độ tinh khiết ~98% và độ ổn định theo lô, với giá chỉ bằng gần một phần ba so với sản phẩm G418 của các công ty khác.

Đặc điểm kỹ thuật	S*	T*	Yeasen	Yeasen lợi thế
Nội dung (HPLC)	/	/	~98%	Độ tinh khiết cao
Hiệu lực (U/mg)	≥720 µg/mg	707-721 µg/mg	≥720 µg/mg	Hiệu quả cao
Giá ($/5 g)	~1000	~1000	~200	Sự rẻ tiền

5 Trường hợp thực nghiệm

Ở E. coli, G69 và G99 là hai lô khác nhau; nồng độ genomycin lần lượt là 8 mg/L, 12 mg/L và 16 mg/L, nồng độ tối thiểu có hiệu quả là 16 mg/L, ức chế hoàn toàn sự phát triển của nhiều loại vi khuẩn khác nhau.