1. Tế bào dendrit (DC) là gì?
Tế bào dạng sợi (DC) là tế bào trình diện kháng nguyên (APC) hiệu quả nhất trong cơ thể người. DC là APC duy nhất có khả năng kích thích mạnh mẽ sự tăng sinh tế bào T ngây thơ. Các loại APC khác (như tế bào đơn nhân, đại thực bào, tế bào B, v.v.) chỉ có thể kích thích tế bào T hoạt hóa hoặc tế bào T nhớ. Do đó, tế bào DC là tác nhân khởi tạo phản ứng miễn dịch tế bào T thích ứng và đóng vai trò cực kỳ quan trọng trong khả năng miễn dịch khối u. Tế bào DC biểu hiện nhiều phân tử MHC-I và MHC-II trên bề mặt của chúng và có các dấu hiệu bề mặt đặc hiệu. Chúng tiếp nhận, xử lý và kích thích tế bào T để kích hoạt kháng nguyên và cuối cùng xác định hướng biệt hóa của tế bào T.
2. Nguồn DC
Tế bào DC có mặt với số lượng rất nhỏ trong cơ thể. Phải mất một thời gian dài để phân lập trực tiếp DC từ cơ thể và sản lượng tế bào rất thấp, điều này hạn chế rất nhiều việc nghiên cứu và ứng dụng DC. Tuy nhiên, DC có thể được phân biệt và tạo ra từ các tế bào tiền thân DC trong các mô khác nhau, chẳng hạn như các tế bào tiền thân trong dịch tủy xương, các tế bào đơn nhân trong máu ngoại vi và máu dây rốn.
Đối với con người, vì máu ngoại vi của con người là thuận tiện nhất để lấy và có số lượng tế bào đơn nhân lớn nhất, phương pháp được sử dụng phổ biến nhất là tạo ra DC từ các tế bào đơn nhân máu ngoại vi của con người (PBMC). Đối với chuột, phương pháp phổ biến nhất là tạo ra DC từ các tế bào tủy xương, cụ thể là các tế bào dendritic có nguồn gốc từ tủy xương (BMDC).
Hình 1. Sơ đồ phương pháp chuẩn bị BMDC cổ điển
3. Phương pháp chuẩn bị BMDC
Các phương pháp phổ biến để chuẩn bị BMDC ở chuột là:
3.1 Phương pháp nuôi cấy BMDC cổ điển - Phương pháp Inaba (đã sửa đổi)
3.2 Chuẩn bị BMDC quy mô lớn - Phương pháp Sons
3.3 Chuẩn bị BMDC quy mô lớn - Phương pháp Lutz
3.1 [Phương pháp nuôi cấy BMDC cổ điển] - Phương pháp Inaba (cải tiến)
【Lý lịch】
Một. Số lượng BMDC thu được bằng phương pháp Inaba là 5-7 x 106/chuột;
b. Phương pháp Inaba ban đầu chỉ sử dụng GM-CSF để kích thích sản xuất BMDC. Mặc dù BMDC thu được có khả năng kích thích mạnh trong phản ứng tế bào lympho hỗn hợp, nhưng độ trưởng thành của DC không tốt bằng khả năng kích thích kết hợp GM-CSF+IL-4. Do đó, phương pháp cải tiến tiếp theo thường sử dụng khả năng kích thích kết hợp GM-CSF+IL-4.
【Các bước trồng trọt】
3.1.1 Thu thập tế bào tủy xương chuột
1) Chuột (6-10 tuần tuổi) bị giết bằng cách trật khớp cổ, tất cả xương đùi và xương chày được cắt bỏ bằng phẫu thuật, và mô cơ xung quanh xương được cắt bỏ càng nhiều càng tốt bằng kéo và kẹp.
[Ghi chú] Không làm tổn thương xương.
2) Chuyển xương đến bệ sạch và ngâm trong đĩa nuôi cấy vô trùng có chứa 70% cồn trong 2-5 phút để khử trùng và tiệt trùng, sau đó rửa hai lần bằng PBS vô trùng.
3) Chuyển xương sang một đĩa nuôi cấy mới khác có chứa PBS, cắt hai đầu xương bằng kéo, sau đó dùng ống tiêm để lấy PBS. Cắm kim vào khoang tủy xương từ cả hai đầu xương và liên tục rửa tủy xương vào đĩa nuôi cấy cho đến khi xương chuyển sang màu trắng hoàn toàn.
4) Thu thập dịch tủy xương và lọc bỏ các mảnh nhỏ và mô cơ bằng lưới nylon 200 mắt.
5) Ly tâm dịch lọc ở 1200 vòng/phút cho 5 phút và loại bỏ phần dịch trong.
6) Thêm 2 ml dung dịch đệm ly giải hồng cầu amoni clorua (1x), huyền phù lại tế bào và ủ ở nhiệt độ phòng trong 3-5 phút, lên đến 10 phút
7) Thêm 10 ml PBS để trung hòa tác dụng của đệm ly giải, sau đó ly tâm ở tốc độ 1200 vòng/phút trong 5 phút và loại bỏ phần dịch trong.
8) Rửa một lần bằng PBS, sau đó huyền phù lại các tế bào trong môi trường nuôi cấy RPMI1640 có chứa 10% FBS. Đã thu được tế bào tủy xương chuột.
Chuẩn bị dung dịch ly giải hồng cầu bằng amoni clorua:
Một. Chuẩn bị dung dịch bảo quản 10x như sau: cân 82,9 gNH4Cl, 10,0g KHCO3 và 0,37g Na2EDTA, hòa tan trong 1L nước cất, lọc bằng 0,22 màng lọc μm để khử trùng và bảo quản ở 4℃ trong 6 tháng;
b. Trước khi sử dụng, pha loãng dung dịch bảo quản 10x với nước cất vô trùng theo tỷ lệ 1:9 với dung dịch làm việc 1x.
[Ghi chú] Do dung dịch phá hồng cầu amoni clorua có tác dụng có hại nhất định đến tế bào tủy xương nên thời gian phá hồng cầu phải được rút ngắn càng nhiều càng tốt.
3.1.2 Cảm ứng biệt hóa BMDC
1) Đếm số tế bào tủy xương chuột thu được ở bước 1 và điều chỉnh nồng độ tế bào thành 0,5-1×106/ml với môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh RPMI 1640 chứa 10% FBS.
2) Đĩa nuôi cấy 24 giếng, 1 ml tế bào cho mỗi giếng, thêm GM-CSF chuột tái tổ hợp (20 ng/mL) và IL-4 (10 ng/mL), và nuôi cấy trong môi trường 37℃, 5% CO2 lò ấp. Đây là ngày thứ 0 của quá trình nuôi cấy.
【Ghi chú】
Một. Nói chung, khoảng 4-5x107 tế bào tủy xương có thể được thu hoạch từ một con chuột, do đó có thể cấy ít nhất 40-50 giếng trong một đĩa 24 giếng.
b. Phạm vi nồng độ của GM-CSF và IL-4 là 20-50 ng/mL và 10-40 ng/mL, tương ứng.
3) Lắc nhẹ đĩa nuôi cấy 2 ngày một lần, sau đó thay 3/4 thể tích bằng môi trường nuôi cấy mới và bổ sung cytokine.
4) Từ ngày thứ 5 đến ngày thứ 8, thổi nhẹ môi trường nuôi cấy để thu thập các tế bào lơ lửng và các tế bào bám lỏng lẻo.
5) Ly tâm ở 1200 vòng/phút cho 5 phút và loại bỏ phần dịch trong.
6) Tái huyền phù các tế bào trong môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh RPMI 1640 chứa 10% FBS và đếm chúng, sau đó điều chỉnh nồng độ tế bào thành 1×106/ml, và thêm chuột GM-CSF tái tổ hợp (20 ng/mL) và IL-4 (10 ng/mL).
7) Đặt tế bào vào đĩa nuôi cấy 100mm (tối đa 10ml mỗi đĩa) hoặc đĩa nuôi cấy 6 giếng (2m/giếng).
8) Tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ 37℃, 5% CO22 ủ trong 1-2 ngày.
9) Thu thập các tế bào lơ lửng, đây là các BMDC trưởng thành hơn.
【Ghi chú】
Một. Các bước 2.5-2.8 là các bước mạ lại, mục đích là để làm cho BMDC thu được ở bước 2.4 trưởng thành hơn.
b. Trong vòng 3 giờ sau khi cấy lại, có thể thấy nhiều tế bào bám dính có gai di chuyển ra khỏi các cụm DC và sau 1 ngày nuôi cấy, các tế bào bám dính này sẽ tách ra khỏi đáy đĩa nuôi cấy và có thể thấy nhiều DC điển hình trôi nổi trong môi trường nuôi cấy.
3.1.3 Sự trưởng thành hoàn toàn của BMDC
[Lưu ý] Các BMDC thu được ở bước 2 không phải là các DC trưởng thành hoàn toàn. Nếu bạn muốn thu được các DC trưởng thành hoàn toàn, bạn vẫn cần được kích thích bởi LPS, CD40L hoặc TNF-a.
1) Ly tâm BMDC thu được ở bước 2.4 hoặc 2.9 ở 1200 vòng/phút cho 5 phút và loại bỏ phần dịch trong.
2) Tái huyền phù chất kết tủa với môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh RPMI có chứa GM-CSF chuột tái tổ hợp (20 ng/mL) và IL-4 (10 ng/mL), và điều chỉnh nồng độ tế bào thành 1×106/ml sau khi đếm.
3) Thêm vào đĩa nuôi cấy 24 giếng và thêm chất gây trưởng thành như TNF-α (250 U/mL), LPS (1 μg/mL), hoặc CD40L (1 μg/mL).
4) Nuôi cấy trong môi trường 37℃, 5% CO2 ủ trong 2 ngày.
5) Thu thập các tế bào lơ lửng và các tế bào phát triển bám lỏng lẻo vào thành tế bào, đây là các tế bào dạng sợi trưởng thành.
3.2【Phương pháp sản xuất hàng loạt BMDC】-Phương pháp con trai
【Lý lịch】
Một. Phương pháp này có thể thu được 30-40×106 DC/chuột trong vòng 7 ngày, gấp 7-10 lần so với phương pháp cổ điển của Inaba. Sau khi DC được ly tâm qua gradient metrizamide 14,5%, độ tinh khiết (tức là tế bào CD11c+/I-Ab+) có thể đạt 85-95%.
b. Khả năng nội bào của DC thu được bằng phương pháp này yếu hơn phương pháp cổ điển của Inaba, nhưng lượng IL-12p70 tiết ra thì tương tự.
c. DC thu được bằng phương pháp này có khả năng kích thích phản ứng tế bào lympho hỗn hợp mạnh hơn phương pháp cổ điển Inaba.
d. DC thu được bằng phương pháp này có thể tạo ra phản ứng tế bào T đặc hiệu mạnh hơn.
nghĩa là Tóm lại, phương pháp Son có thể thu được BMDC trưởng thành hơn và hoàn thiện hơn so với phương pháp cổ điển.
【Các bước trồng trọt】
3.2.1 Thu thập tế bào tủy xương chuột
Xem các bước tương ứng trong phương pháp Inaba (đã sửa đổi).
3.2.2 Chuẩn bị số lượng lớn BMDC
1) Đếm số tế bào tủy xương chuột thu được ở bước 1 và điều chỉnh nồng độ tế bào thành 2×105/ml với môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh RPMI 1640 chứa 10% FBS.
2) Trải vào các đĩa nuôi cấy 6 giếng, 5 ml tế bào mỗi giếng, thêm GM-CSF chuột tái tổ hợp (1000 U/mL) và IL-4 (1000 U/mL), và nuôi cấy trong môi trường 37℃, 5% CO2 máy ấp.
3) Vào ngày thứ 4 của quá trình nuôi cấy, bổ sung hệ thống nuôi cấy bằng GM-CSF chuột tái tổ hợp (1000 U/mL) và IL-4 (1000 U/mL).
4) Thu thập DC vào ngày thứ 7 của quá trình nuôi cấy, tái huyền phù với 2-4 ml RPMI 1640 môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh, thêm vào một thể tích bằng nhau là 14,5% (w/v) mepanema, và ly tâm ở nhiệt độ phòng trong 20 tối thiểu ở 1200xg.
5) Thu thập lớp giữa và rửa ba lần bằng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh RPMI 1640 để sử dụng sau.
[Ghi chú] DC tại thời điểm này là BMDC chưa trưởng thành. Nếu bạn muốn trưởng thành hơn nữa, vui lòng bỏ qua bước 3.
3.2.3 Sự trưởng thành hoàn toàn của BMDC
1) Mạ lại các BMDC thu thập được ở bước 2.4 và thêm GM-CSF chuột tái tổ hợp (1000 U/mL) và IL-4 (1000 U/mL), cũng như LPS (1-10 μg/mL) vào hệ thống văn hóa
2) Nuôi cấy ở nhiệt độ 37℃, 5% CO22 ủ trong 2 ngày để thu được BMDC trưởng thành.
3.3【Phương pháp chuẩn bị khối lượng BMDC】-Phương pháp Lutz
【Lý lịch】
Một. Phương pháp Lutz tương tự như phương pháp Son và cả hai phương pháp đều có thể điều chế BMDC với số lượng lớn, nhưng phương pháp Lutz được sử dụng rộng rãi hơn phương pháp Son.
b. Phương pháp này có thể thu được nhiều BMDC hơn, lên tới 1-3 x 108 DC/chuột, độ tinh khiết có thể đạt tới 90-95%;
c. Nồng độ cytokine được sử dụng trong phương pháp này thấp hơn nhiều so với phương pháp Son, chỉ 200 U/mLvà nó giảm xuống còn 30-100 U/mL từ ngày thứ 8 đến ngày thứ 10 của quá trình nuôi cấy, có thể tiết kiệm đáng kể chi phí thuốc thử;
d. Sự khác biệt lớn nhất giữa phương pháp này với phương pháp Inaba cổ điển và phương pháp Son là các tế bào tủy xương được nuôi cấy trong đĩa nuôi cấy vi khuẩn (đĩa Petri) thay vì đĩa nuôi cấy tế bào. Inaba giải thích rằng đĩa nuôi cấy vi khuẩn không dễ để các đại thực bào trong tủy xương bám vào thành, do đó ức chế sự phát triển của các đại thực bào và tránh tác dụng ức chế của các đại thực bào đối với quá trình trưởng thành của DC. Đây có thể là lý do chính tại sao phương pháp này có thể thu được một số lượng lớn BMDC ở mật độ mạ thấp hơn.
nghĩa là Tuy nhiên, thời gian nuôi cấy của phương pháp này tương đối dài, cần 10-12 ngày. Một mặt, điều này là để thu được nhiều BMDC hơn. Mặt khác, hầu hết các bạch cầu hạt và tế bào lympho đều khó có thể tồn tại trong thời gian dài như vậy, vì vậy độ tinh khiết của BMDC cuối cùng thu được có thể được cải thiện;
f. Phương pháp này chỉ sử dụng GM-CSF để nuôi cấy cảm ứng, và BMDC thu được chứa cả DC chưa trưởng thành và trưởng thành. Để cải thiện thêm độ trưởng thành, cần sử dụng LPS hoặc TNF-α trong 1-2 ngày cảm ứng nữa, và hàm lượng tế bào DC trưởng thành sẽ đạt 50-70%.
【Các bước trồng trọt】
3.3.1 Thu thập tế bào tủy xương chuột
Xem các bước tương ứng trong phương pháp Inaba (đã sửa đổi) và lưu ý rằng bước tan máu phải được bỏ qua.
3.3.2 Chuẩn bị BMDC quy mô lớn
1) Đếm số tế bào tủy xương chuột thu được ở bước 1 và điều chỉnh nồng độ tế bào thành 2×105/ml với môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh RPMI 1640 chứa 10% FBS;
2) Trải vào các đĩa nuôi cấy vi khuẩn 100mm (Đĩa Petri), 10ml tế bào mỗi đĩa và thêm GM-CSF chuột tái tổ hợp (200 U/mL), và nuôi cấy ở nhiệt độ 37℃, 5% CO2 trong tủ ấm;
[Ghi chú] Ở đây sử dụng đĩa nuôi cấy vi khuẩn chứ không phải đĩa nuôi cấy tế bào.
3) Vào ngày thứ 3, thêm 10ml môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh chứa 20 ng/mL chuột tái tổ hợp GM-CSF vào đĩa nuôi cấy;
4) Ngày thứ 6 và ngày thứ 8, thay một nửa môi trường, tức là thu lại môi trường nuôi cấy cũ, huyền phù lại cặn tế bào bằng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh có chứa 20 ng/mL chuột GM-CSF tái tổ hợp sau khi ly tâm, sau đó đưa hỗn dịch tế bào trở lại đĩa ban đầu;
5) Vào ngày thứ 10, có thể thu thập được các tế bào, đó là BMDC.
3.3.3 Sự trưởng thành hoàn toàn của BMDC
1) Thu thập các tế bào lơ lửng bằng cách thổi nhẹ các DC vào ngày thứ 10 của quá trình nuôi cấy bằng pipet và ly tâm ở tốc độ 300xg trong 5 phút ở nhiệt độ phòng;
2) Loại bỏ phần dịch nổi, tái huyền phù cặn tế bào bằng 10 ml môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh RPMI 1640, sau đó rải lên đĩa nuôi cấy tế bào có đường kính 100 mm;
3) Thêm chuột tái tổ hợp GM-CSF (100 U/mL) và TNF-α (500 U/mL), hoặc chuột GM-CSF tái tổ hợp (100 U/mL) và LPS (1 μg/mL);
4) Tiếp tục nuôi cấy ở nhiệt độ 37℃, 5% CO22 ủ trong 1-2 ngày.
4. Xác định BMDC
tôi Quan sát hình thái: Hầu hết BMDC phát triển thành từng khuẩn lạc và các tế bào có nhiều phần nhô ra dạng cây, điều này dễ thấy hơn ở BMDC trưởng thành.
tôi Phân tích kiểu hình tế bào: Đo lưu lượng tế bào được sử dụng để phát hiện biểu hiện của các phân tử CD11c, CD40, CD80, CD86, MHC lớp II (IA/IE) trên bề mặt tế bào DC. BMDC biểu hiện cao các phân tử này và biểu hiện của các phân tử này trong BMDC trưởng thành hoàn toàn sẽ được tăng cường hơn nữa.
tôi Phản ứng tế bào lympho hỗn hợp (MLR): BMDC có khả năng kích thích mạnh, độ trưởng thành càng cao thì khả năng kích thích càng mạnh.
5. Làm thế nào để chọn chất kích thích trưởng thành?
LPS, CD40L và TNF-α là những chất gây trưởng thành thường được sử dụng và hiệu quả cho cả DC ở người và DC ở chuột. TNF-α có khả năng yếu nhất trong việc gây trưởng thành DC trong ba loại. LPS và CD40L đều là những chất gây trưởng thành hoàn toàn của DC trong ống nghiệm. Sự trưởng thành của DC do cả hai chất gây ra là tương tự nhau, nhưng phổ cytokine gây ra thì khác nhau. BMDC trưởng thành do CD40L gây ra cho thấy khả năng điều hòa miễn dịch mạnh nhất trong cơ thể sống, bao gồm cả việc tạo ra các phản ứng miễn dịch bảo vệ và điều trị khối u. Nồng độ được sử dụng để kích thích sự trưởng thành hoàn toàn của DC bằng LPS thường là 1-10 μg/mL, nhưng thực tế 0,1 μg/mL có tác dụng rất mạnh, nhưng vì mục đích bảo hiểm, 1 μg/mL thường được sử dụng. Cần lưu ý rằng các phân tử CD40L thuộc họ phối tử TNF, được đặc trưng bởi thực tế là chúng chỉ có thể hoạt động sau khi hình thành trimer. Do đó, tốt nhất là sử dụng protein trimer CD40L tái tổ hợp để kích thích DC, điều này sẽ có hiệu quả tốt. Nếu sử dụng monome CD40L để kích thích DC, độ trưởng thành không cao trong hầu hết các trường hợp.
6. Lựa chọn phương pháp đào tạo
Bảng 1.So sánh ba phương pháp thử nghiệm phổ biến để chuẩn bị BMDC
| Tham số | Phương pháp nuôi cấy BMDC cổ điển - Phương pháp Inaba | Chuẩn bị BMDC quy mô lớn - Phương pháp Son | Chuẩn bị BMDC quy mô lớn - Phương pháp Lutz |
| Số lượng trích dẫn trong PubMed | 783 | 24 | 663 |
| Tan máu tủy xương, tan hồng cầu | ĐÚNG | ĐÚNG | KHÔNG |
| Tủy xương đầu tiên loại bỏ tế bào lympho | ĐÚNG | KHÔNG | KHÔNG |
| Loại bỏ bạch cầu hạt trong quá trình nuôi cấy | ĐÚNG | KHÔNG | KHÔNG |
| Thể tích mạ ban đầu của tế bào tủy xương | 1ml | 15ml | 10ml |
| Máy ấp | Đĩa nuôi cấy tế bào 24 giếng | Đĩa nuôi cấy tế bào 6 giếng | Đĩa nuôi cấy vi khuẩn 100mm |
| Môi trường nuôi cấy | RPMI 1640+10% FCS | ||
| Nồng độ GM-CSF của chuột | 200-1000 U/mL | Nồng độ ban đầu được thêm vào là 125-1000 U/mL Vào ngày thứ 4 và ngày thứ 7, bổ sung một lượng đủ GM-CSF và IL-4 vào hệ thống nuôi cấy. | Nồng độ ban đầu được thêm vào là 200 U/mL.3-100 U/mL sau ngày thứ 10 |
| Chuột IL-4 | Không cần | Nhu cầu，Nồng độ giống như GM-CSF | Không cần |
| Phương pháp trao đổi chất lỏng | Vào ngày thứ 2 và ngày thứ 4, loại bỏ 50%-75% môi trường nuôi cấy cũ (có chứa tế bào) và thay thế bằng môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh mới có chứa đủ GM-CSF. | / | Vào ngày thứ 3, một thể tích bằng nhau của môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh có chứa GM-CSF đã được thêm vào. Vào ngày thứ 6, 8 và 10, một nửa môi trường đã được thay thế. Môi trường nuôi cấy cũ (có chứa tế bào) đã được hút, ly tâm, tái huyền phù trong môi trường nuôi cấy hoàn chỉnh mới có chứa GM-CSF và sau đó đưa trở lại. |
| Thời gian nuôi cấy trước khi truyền (mở rộng) | 6 ngày | 7 ngày | 10 ngày |
| Thời gian nuôi cấy sau khi chuyển gen (trưởng thành) | 2 ngày | Không có | 1-2 ngày |
| Chất kích thích trưởng thành đầy đủ | TNF-ɑ（250 U/mL) | LPS(1-10 μg/mL) | TNF-ɑ（250 U/mL)hoặc LPS(1 μg/mL) |
| Thời gian thu hoạch tế bào DC | 7-8 ngày | 7-8 ngày | 10-13 ngày |
| Độ tinh khiết của DC | Ngày thứ 8：60-70% | Ngày thứ 7：85-95% | Ngày 10-12：80-90% |
| Sản xuất DC/chuột | (5-7)×106 | (3-4)×107 | (1-3)×108 |
7. Thuốc thử nuôi cấy DC được khuyến nghị
| Tên sản phẩm | Con mèo | Kích cỡ |
| 91108Tiếng Việt | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| 90144ES | 5 μg/50 μg/100 μg/500 μg | |
| 90621ES | 5 μg/20 μg/50 μg/500 μg | |
| 94016ES | 25 μg/100 μg/500 μg |