1.Bối cảnh của Laminin 521
Laminin 521 (LN521) là một protein kết dính tế bào quan trọng trong hốc tế bào gốc tự nhiên và là một ma trận cho nuôi cấy và mở rộng tế bào gốc phôi người (hES) và tế bào gốc đa năng cảm ứng (hiPSC). LN521 liên kết với các thụ thể bề mặt tế bào và kích hoạt các con đường truyền tín hiệu tế bào, dẫn đến sản xuất nhiều tế bào chức năng hơn.
Laminin 521 tái tạo môi trường hPSC có liên quan về mặt sinh học trong ống nghiệm, thúc đẩy sự bám dính, khả năng sống sót cao và khả năng tự tái tạo mạnh mẽ trong thời gian dài của hPSC, đồng thời là protein nền quan trọng hỗ trợ sự phát triển của tế bào gốc và duy trì sự ổn định của cấu trúc và hiệu suất của màng đáy. Laminin 521 cũng là một trong những nền nuôi cấy không chứa chất dinh dưỡng được sử dụng phổ biến nhất. Ngoài ra, Laminin 521 có thể đạt được sự truyền tế bào đơn lẻ hiệu quả của các tế bào gốc ổn định về mặt di truyền và đa năng mà không cần thêm bất kỳ chất ức chế apoptosis nào. Các tế bào phát triển thành một lớp đơn đồng nhất mà không cần phải loại bỏ thủ công bất kỳ vùng biệt hóa nào. Ngoài ra, các nghiên cứu đã chỉ ra rằng LN521 có thể hỗ trợ sự phát triển của PSC trong hơn 10 thế hệ mà không có bất kỳ dấu hiệu bất thường nào về kiểu nhân và duy trì khả năng phân hóa của PSC thành ba lớp mầm là lớp mầm bên trong, giữa và ngoài.
Hình 1. Cấu trúc Laminin 521 [1]
2.Thí nghiệm phủ Laminin
2.1 Chuẩn bị laminin 521 thành 400µg/ml bằng nước khử ion vô trùng hoặc nước pha tiêm. Nên pha loãng thêm đến 100µg/ml bằng 1×DPBS (Ca++/Mg++) vô trùng trước khi sử dụng, sau đó pha loãng đến nồng độ làm việc là 5-10µg/ml bằng DPBS (Ca++/Mg++) vô trùng. Nồng độ lớp phủ thay đổi tùy thuộc vào loại tế bào nuôi cấy và nên tối ưu hóa quy trình thử nghiệm để xác định nồng độ lớp phủ tối ưu cho tế bào. Tham khảo Bảng 1 để biết nồng độ khuyến nghị.
Ghi chú: DPBS chứa Ca2+ và Mg2+ nên được sử dụng, vì các cation hóa trị hai rất quan trọng đối với cấu trúc và chức năng của protein. Nồng độ làm việc cần thiết của Laminin 521 phụ thuộc vào các tế bào và ứng dụng. Chúng tôi khuyến nghị nồng độ phủ ban đầu là 0,5μg/cm2.
Bảng 1. Thể tích khuyến nghị của dung dịch làm việc laminin tái tổ hợp của con người cho các bình nuôi cấy khác nhau.
| Đĩa Petri | Nồng độ lớp phủ (μg/mL) | Lượng bổ sung LN521 | Số lượng bổ sung 1*DPBS | Tổng khối lượng |
| 6 giếng | 5 | 50 μL/giếng | 950 μL/giếng | 1 mL/giếng |
| 12 giếng | 5 | 25 μL/giếng | 475 μL/giếng | 0,5 mL/giếng |
| 24 giếng | 5 | 15 μL/giếng | 285 μL/giếng | 0,3 mL/giếng |
| 48 giếng | 5 | 7,5 μL/giếng | 142,5 μL/giếng | 150 μL/giếng |
| 96 giếng | 5 | 3,5 μL/giếng | 66.5 μL/giếng | 70 μL/giếng |
| Đĩa Petri 35mm | 5 | 50 μL/giếng | 950 μL/giếng | 1 mL/giếng |
| Đĩa Petri 60mm | 5 | 100 μL/giếng | 1900 μL/giếng | 2 mL/giếng |
| Đĩa Petri 100mm | 5 | 300 μL/giếng | 5700 μL/giếng | 6 mL/giếng |
Thể tích trên dựa trên nồng độ lớp phủ là 5μg/mL.
2.2 Thêm thể tích hỗn hợp laminin-DPBS đã chỉ định vào mỗi giếng và lắc nhẹ. Đảm bảo toàn bộ bề mặt được phủ dung dịch phủ laminin, vì bề mặt không phủ không hỗ trợ sự phát triển của tế bào.
2.3. Đặt đĩa vào tủ ấm 37°C và ủ qua đêm. Thời gian ủ tối thiểu là 2 giờ, nhưng nên ủ qua đêm để có được điều kiện nuôi cấy tế bào lý tưởng. Cẩn thận không để hộp đựng nuôi cấy bị khô, điều này sẽ làm bất hoạt LN521.
2.4. Khi tế bào đã sẵn sàng để gieo hạt, hãy hút dung dịch laminin 521.
3. Văn hóa iPSC
3.1 Rã đông iPSC (lấy đĩa 12 giếng làm ví dụ)
3.1.1 Lấy tế bào iPSC ra khỏi nitơ lỏng hoặc đá khô và rã đông trong nước 37°C trong 10 giây.
3.1.2 Khử trùng lọ đựng mẫu bằng cồn 75% và chuyển chúng lên bề mặt làm việc.
3.1.3 Chuyển tế bào sang ống ly tâm 15 mL mới chứa 9 mL DMEM‑F12.
3.1.4 Ly tâm ống ly tâm 15 mL ở tốc độ 300g trong 5 phút ở nhiệt độ phòng.
3.1.5 Đổ bỏ dung dịch laminin ra khỏi đĩa 12 giếng đã tráng.
3.1.6 Loại bỏ phần dịch nổi của tế bào và nhẹ nhàng tái huyền phù các tế bào iPSC trong 1 mL mTeSR-plus (chứa 10 µM Y-27632) và chuyển chúng vào đĩa 12 giếng đã tráng. Lắc đĩa để phân phối đều các tế bào đến mật độ tế bào cuối cùng là 1×10^5 tế bào/giếng và để yên ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Đảm bảo rằng nuôi cấy được thực hiện trong vòng 4-5 ngày.
3.1.7 Đặt lại đĩa 12 giếng vào tủ ấm 37°C để ủ.
3.1.8 Môi trường nuôi cấy có chứa chất ức chế ROCK phải được loại bỏ sau 12-16 giờ và tiếp tục nuôi cấy trong môi trường không có chất ức chế.
Bảng 2. Mật độ gieo hạt tế bào trong các bình nuôi cấy khác nhau, số lượng tế bào được xác định theo tốc độ tăng trưởng của tế bào
| Bình nuôi cấy tế bào | 6 giếng | 12 giếng | 24 giếng | 96 giếng |
| Số lượng tế bào | 2,5~3,5×105 | 6~8×104 | 3~4×104 | 0,5~1×104 |
3.2. Giao thức truyền iPSC
3.2.1 Loại bỏ phần dịch nuôi cấy và rửa sạch bằng 1 mL PBS (Ca‑‑/Mg‑‑).
Ghi chú: Sử dụng PBS không có Ca2+ và Mg2+ vì các cation hóa trị hai có tác động tiêu cực đến một số enzym phân ly.
3.2.2 Bỏ PBS và thêm 0,5 mL Thuốc thử phân ly tế bào nhẹ nhàng.Ủ ở nhiệt độ phòng trong 6-8 phút hoặc quan sát dưới kính hiển vi cho đến khi tế bào không còn bám vào đĩa.
3.2.3 Thêm một thể tích bằng DMEM-F12, nhẹ nhàng trộn các tế bào, chuyển vào ống ly tâm ở nhiệt độ phòng và ly tâm ở tốc độ 300g trong 5 phút.
3.2.4 Trước khi cấy tế bào, chuẩn bị một đĩa 12 giếng phủ laminin.
3.2.5 Loại bỏ phần chất lỏng trong và tái huyền phù các tế bào trong môi trường mTeSR‑plus chứa 10 µM Y‑27632.
3.2.6 Chuyển tế bào vào đĩa 12 giếng đã phủ laminin. Lắc nhẹ đĩa để phân bố đều tế bào và để ở nhiệt độ phòng trong 10 đến 20 phút.
3.2.7 Đặt đĩa 12 giếng vào tủ ấm 37°C và ủ.
Ghi chú: iPSC sẽ nhanh chóng phân hóa và chết sau khi phát triển thành một lớp đơn. Để duy trì sự tăng trưởng và tính đa năng, chúng cần được truyền qua trước khi chúng hợp lưu.
3.3. Bảo quản lạnh iPSC
3.3.1 Chuẩn bị thuốc thử phân ly tế bào nhẹ nhàng.
3.3.2 Thực hiện tách tế bào theo giao thức chuyển tế bào iPSC, sử dụng số lượng bào quan tế bào để đảm bảo mật độ tế bào trước khi bảo quản lạnh.
3.3.3 Mỗi ống tế bào phải được đông lạnh ở mật độ tế bào 1-2×10^6. Thực hiện các bước ly tâm và loại bỏ môi trường nuôi cấy tế bào trong giao thức truyền tế bào iPSC. Tái huyền phù viên tế bào iPSC đã phân lập trong một thể tích dung dịch bảo quản lạnh thích hợp
3.3.4 Thêm 1 mL viên bảo quản đông lạnh tế bào đã được hồi lưu vào ống bảo quản đông lạnh 1,5 mL, thực hiện làm lạnh theo chương trình, sau đó chuyển vào nitơ lỏng để bảo quản lâu dài.
4. Lưu ý quan trọng về lớp phủ Laminin
4.1. Tất cả các bước trong quy trình thử nghiệm phải được thực hiện trong điều kiện vô trùng.
4.2. Tránh để laminin ở nhiệt độ phòng trong thời gian dài.
4.3. Tránh việc đông lạnh và rã đông nhiều lần
4.4. Sau khi rã đông, dung dịch protein gốc chưa pha loãng có thể được bảo quản ở nhiệt độ 2~8℃ trong điều kiện vô trùng và có thể bảo quản ổn định trong ít nhất 3 tháng.
5. Thông tin sản phẩm liên quan
| Tên sản phẩm | Con mèo# | Kích cỡ |
| Protein Laminin 521 của người tái tổ hợp (không có nguồn gốc từ động vật) | 92602ES | 10μg/100μg/500μg/1mg |
6. Tài liệu tham khảo
[1]Pulido D, Briggs DC, Hua J, Hohenester E. Phân tích tinh thể học của cánh tay ngắn laminin β2 cho thấy cách miền LF được chèn vào một mảng thông thường của miền LE. Matrix Biol. 2017 tháng 1;57-58:204-212.