Thuốc Puromycine là một loại kháng sinh aminoglycoside được sản xuất bởi Streptomyces alboniger. Nó là một chất tương tự của đầu 3' của phân tử aminoacyl-tRNA và có thể liên kết với vị trí A của ribosome, kết hợp vào chuỗi peptide kéo dài, phá vỡ sự chuyển vị peptide trên ribosome, gây ra sự kết thúc chuỗi sớm trong quá trình dịch mã và do đó ức chế quá trình tổng hợp protein.
Hình 1 Công thức cấu trúc của Puromycin (CAS NO. 53-79-2)
Gen pac, mã hóa puromycin N-acetyltransferase (pac), được tìm thấy trong vi khuẩn sản xuất Puromycin là Streptomyces alboniger, mang lại khả năng kháng puromycin. Đặc điểm này hiện được sử dụng rộng rãi để sàng lọc các dòng tế bào chuyển gen ổn định ở động vật có vú mang plasmid có gen pac. Việc sử dụng rộng rãi puromycin trong quá trình sàng lọc các dòng tế bào ổn định có liên quan đến các đặc điểm của vectơ lentivirus, phần lớn trong số đó mang gen pac trong các vectơ lentivirus thương mại. Trong một số trường hợp cụ thể, puromycin cũng có thể được sử dụng để sàng lọc các chủng E. coli được chuyển gen với plasmid mang gen pac. Puromycin hoạt động nhanh và có thể nhanh chóng gây chết tế bào ở nồng độ thấp. Các tế bào động vật có vú bám dính nhạy cảm với nồng độ 2-5 µg/mL của puromycin, trong khi các tế bào huyền phù đã nhạy cảm với nồng độ thấp tới 0,5-2 µg/mL puromycin. Các tế bào động vật có vú có khả năng kháng puromycin ổn định có thể được tạo ra trong vòng một tuần.
Sàng lọc dòng tế bào ổn định
Nguyên lý thực nghiệm
Bằng cách nhân bản DNA/shRNA ngoại sinh vào vectơ mang gen pac, vectơ tái tổ hợp được chuyển vào tế bào vật chủ và tích hợp vào nhiễm sắc thể của chúng, truyền ổn định thông qua phân chia tế bào và cuối cùng được sàng lọc bằng puromycin.
Chuẩn bị và tiền thí nghiệm
1 Nồng độ sử dụng được khuyến nghị
Tế bào động vật có vú: 1-10 μg/mL, nồng độ tối ưu cần được xác định trước khi thử nghiệm.
E. coli: Để sàng lọc E. coli chuyển đổi ổn định mang gen pac trên môi trường thạch LB, sử dụng nồng độ 125 μg/mL. Cần điều chỉnh pH chính xác để sàng lọc puromycin đối với các chủng chuyển đổi ổn định E. coli.
2 Phương pháp hòa tan
Hòa tan puromycin trong nước cất để chuẩn bị dung dịch gốc 50 mg/mL, lọc khử trùng bằng bộ lọc 0,22 μm, chia thành từng phần và bảo quản ở -20°C.
3 Xác định đường cong tiêu diệt Puromycin (sử dụng chuyển gen shRNA hoặc chuyển gen lentivirus làm ví dụ)
Nồng độ sàng lọc hiệu quả của puromycin liên quan đến loại tế bào, trạng thái tăng trưởng, mật độ tế bào, quá trình chuyển hóa tế bào và vị trí chu kỳ tế bào. Điều quan trọng là phải xác định nồng độ puromycin tối thiểu có thể tiêu diệt các tế bào chưa chuyển gen. Điều cần thiết là phải thực hiện sàng lọc trước theo gradient Puromycin cho thí nghiệm đầu tiên để thiết lập đường cong tiêu diệt.
- Tế bào dạng tấm có mật độ 5~8×104tế bào/giếng trong đĩa 24 giếng và nuôi cấy qua đêm.
- Chuẩn bị môi trường sàng lọc: Môi trường mới chứa các nồng độ puromycin khác nhau (ví dụ: 0-15 μg/mL, ít nhất 5 độ dốc).
- Thay thế bằng môi trường sàng lọc mới chuẩn bị, tiếp tục nuôi cấy và quan sát sự phát triển của tế bào, thay môi trường sàng lọc mới sau mỗi 2-3 ngày.
- Quan sát sự sống còn của tế bào hàng ngày; nồng độ thuốc có hiệu quả tiêu diệt tất cả các tế bào không được chuyển gen trong vòng 4-6 ngày là nồng độ tối thiểu.
Sàng lọc các chất chuyển gen ổn định
- Sau khi nhiễm lentivirus trong 48-72 giờ (70-80% hợp lưu), nuôi cấy tế bào trong môi trường chứa nồng độ Puromycin thích hợp trong ít nhất 48 giờ. Khi tất cả các tế bào trong nhóm đối chứng không được chuyển gen bằng puromycin chết, các tế bào còn lại trong nhóm bị nhiễm virus đều là tế bào dương tính.
【Lưu ý】: ① Tác dụng của kháng sinh rõ rệt nhất khi tế bào đang trong giai đoạn phân chia tích cực. Hiệu quả của kháng sinh sẽ giảm đáng kể nếu tế bào quá dày đặc. Mật độ tế bào không được vượt quá 25%. ② Quan sát tình trạng tăng trưởng tế bào hàng ngày; sàng lọc puromycin cần ít nhất 48 giờ và nồng độ sàng lọc puromycin có hiệu quả thường kéo dài từ 3 đến 10 ngày. MOI của vi-rút càng cao thì mỗi tế bào chứa càng nhiều bản sao shRNA và gen kháng puromycin. Khi thực hiện sàng lọc puromycin, MOI càng cao thì tế bào chứa càng nhiều bản sao pac và nồng độ puromycin mà chúng có thể dung nạp càng cao. Điều chỉnh nồng độ puromycin để sàng lọc các tế bào được chuyển gen, nhưng nồng độ puromycin không được thấp hơn nồng độ có hiệu quả tối thiểu của đường cong tiêu diệt;
- Thêm môi trường nuôi cấy có chứa nồng độ Puromycin tối thiểu để nhân rộng tế bào và sau khi kết quả xét nghiệm qPCR đạt yêu cầu, tiến hành bảo quản lạnh.
| Sản phẩmS tên | Con mèo# | Đặc điểm kỹ thuật | Vẻ bề ngoài |
| Thuốc Puromycine Dihydroclorua CAS: 58-58-2 | 60210ES25 | 25mg | Bột màu trắng đến trắng như bột |
| 60210ES60 | 100mg | ||
| 60210ES72 | 250mg | ||
| 60210ES76 | 500mg | ||
| 60210ES80 | 1 g | ||
| Thuốc Puromycine (Dung dịch 10 mg/mL) CAS: 58-58-2 | 60209ES10 | 1×1 mL | Dung dịch (10 mg/mL trong H2Ồ） |
| 60209ES50 | 5×1 mL | ||
| 60209ES60 | 10×1 mL | ||
| 60209ES76 | 50×1mL |
Khuyến nghị sản phẩm
Ấn phẩm của khách hàng sử dụng sản phẩm này (Thống kê một phần: Một số)
[1] Zhang D, Liu Y, Zhu Y, et al. Một con đường cGAS -STING-PERK không điển hình tạo điều kiện cho chương trình dịch mã quan trọng đối với tình trạng lão hóa và xơ hóa cơ quan. Tế Bào Nat . 2022;24(5):766- 782. doi:10.1038/s41556-022-00894-z (IF:28.824)
[2] Lu T, Zhang Z, Zhang J, et al. CD73 trong các túi ngoại bào nhỏ có nguồn gốc từ HNSCC xác định tình trạng ức chế miễn dịch liên quan đến khối u được trung gian bởi các đại thực bào trong môi trường vi mô. J Túi ngoại bào . 2022;11(5):e12218. doi:10.1002/jev2.12218 (IF:25.841)
[3] Mạnh F, Yu Z, Zhang D, và cộng sự.Sự tách pha cảm ứng của NF2 đột biến làm hạn chế cơ chế cGAS-STING để hủy bỏ khả năng miễn dịch chống khối u. Tế bào Mol . 2021;81(20):4147-4164.e7.doi: 10.1016/j.molcel.2021.07.040 (IF:17.970)
[ 4] Chen S, Liu S, Wang J, et al. Nhắm mục tiêu DRP1 qua TBK1 mang lại khả năng cảm nhận axit nucleic để lập trình lại động lực và sinh lý ty thể. Tế bào Mol . 2020;80(5):810-827.e7.doi:10.1016 /j.molcel.2020.10.018 (NẾU:15.584)
[5] Zhao Q, Zheng K, Ma C, et al. PTPS tạo điều kiện cho quá trình LTBP1 S-Nitrosyl hóa theo ngăn và thúc đẩy sự phát triển của khối u trong điều kiện thiếu oxy. Tế bào Mol . 2020;77(1 ):95-107.e5. doi:10.1016/j.molcel.2019.09.018 (NẾU:14.548)
[6] Mo J, Liu F, Sun X, et al. Sự ức chế của phức hợp FACT nhắm vào tín hiệu Hedgehog bất thường và khắc phục khả năng kháng thuốc đối kháng được làm mịn. Nghiên cứu ung thư . 2021;81(11):3105-3120. doi:10.1158/0008-5472.CAN-20-3186 (NẾU:12.701)
[7] Zou Y, Wang A, Shi M, et al. Phân tích cảnh quan oxy hóa khử và động lực học trong tế bào sống và trong cơ thể sống bằng cách sử dụng các cảm biến huỳnh quang được mã hóa di truyền. Quy định quốc gia . 2018;13(10):2362-2386. doi:10.1038/s41596-018-0042-5 (NẾU:12.423)
[8] Mao L, Chen J, Lu X, et al. Phân tích proteomic của tế bào ung thư phổi cho thấy vai trò quan trọng của BCAT1 trong di căn tế bào ung thư. Chẩn đoán và điều trị. 2021;11(19):9705-9720. Xuất bản 2021 Ngày 27 tháng 9. doi:10.7150/thno.61731 (NẾU:11.556)
[9] Han L, Zhang F, Liu Y, et al. Protein liên kết globulin tử cung 1 (UGRP1) liên kết với podoplanin (PDPN) để thúc đẩy một con đường viêm mới trong quá trình nhiễm Streptococcus pneumoniae. Dịch thuật lâm sàng Med. 2022;12(6):e850. doi:10.1002/ctm2.850 (IF:11.492)
[10] Zhang M, Liu F, Zhou P, et al. Con đường truyền tín hiệu MTOR điều chỉnh sự biệt hóa đại thực bào từ tiền thân tủy chuột bằng cách ức chế quá trình tự thực. Tự thực . 2019;15(7):1150-1162. doi:10.1080/15548627.2019. 1578040 (NẾU:11.059)
[11] Zhang S, Yang Z, Bao W, et al. SNX10 (phân loại nexin 10) ức chế sự khởi phát và tiến triển của ung thư trực tràng bằng cách kiểm soát quá trình phân hủy tự thực của SRC. Tự thực . 2020;16(4):735 -749. doi:10.1080/15548627.2019.1632122 (NẾU:11.059)
[12] Zhang Y, Ding H, Wang X, et al. MK2 thúc đẩy quá trình phân hủy Tfcp2l1 thông qua β-TrCP ubiquitin ligase để điều chỉnh quá trình tự đổi mới tế bào gốc phôi chuột. Đại diện tế bào . 2021;37(5):109949. doi:10.1016/j.celrep.2021.109949 (NẾU:9.423)
[13] Jiang Y, Dong Y, Luo Y, et al. Quá trình phosphoryl hóa trung gian bởi AMPK trên 53BP1 thúc đẩy c-NHEJ. Đại diện tế bào . 2021;34(7):108713. doi:10.1016/j.celrep.2021.108713 (NẾU:9.423)
[14] Sun Q, Ye Y, Gui A, et al. MORTALIN-Ca 2+ trục thúc đẩy khả năng kháng rituximab bẩm sinh ở bệnh u lympho tế bào B lớn lan tỏa. Ung thư Lett . 2022;537:215678. doi:10.1016/j.canlet.2022.215678 (IF:8.679)
[15] Jin R, Zhao A, Han S, et al. Sự tương tác của S100A16 và GRP78 kích hoạt căng thẳng lưới nội chất thông qua con đường IRE1α/XBP1 trong xơ ống kẽ thận. Tế bào chết Dis . 2021;12(10):942. Xuất bản ngày 13 tháng 10 năm 2021. doi: 10.1038/s41419-021-04249-8 (NẾU:8.469)
[16] Trương P, Trương Z, Phúc Y, và cộng sự.Ubiquitin hóa liên kết K63 của DYRK1A được làm giảm bởi sự thoái hóa EGFR do TRAF2 Sprouty 2 làm trung gian. Tế bào chết Dis . 2021;12(6):608. Xuất bản ngày 11 tháng 6 năm 2021. doi:10.1038/s41419-021-03887-2 (NẾU:8.469)
[17] Zhao T, Li Y, Shen K, Wang Q, Zhang J. Việc loại bỏ OLR1 làm suy yếu quá trình chuyển hóa đường phân để ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư ruột kết và khả năng kháng thuốc bằng cách giảm điều hòa SULT2B1 thông qua c-MYC. Sự chết của tế bào 2021;13(1):4. Xuất bản ngày 17 tháng 12 năm 2021. doi: 10.1038/s41419-021-04174-w (NẾU:8.469)
[18] Zhou R, Wu Q, Wang M, et al. Protein phosphatase PPM1A khử phosphoryl hóa và kích hoạt YAP để điều chỉnh quá trình tái tạo gan và ruột ở động vật có vú. Tiểu sử PLoS . 2021; 19(2):e3001122. Xuất bản ngày 25 tháng 2 năm 2021. doi:10.1371/journal.pbio.3001122 (NẾU:8.029)
[19] Wu S, Wang S, Lin X, Yang S, Ba X, Xiong D, Xiao L, Li R. Lanatoside C ức chế sự nhân lên của virus herpes simplex 1 bằng cách điều chỉnh sự phân bố NRF2 trong tế bào. Dược thảo. 2024 Tháng 2;124:155308. doi: 10.1016/j.phymed.2023.155308. (NẾU NHƯ:7.9)
[20] Shen K, Song W, Wang H, Wang L, Yang Y, Hu Q, Ren M, Gao Z, Wang Q, Zheng S, Zhu M, Yang Y, Zhang Y, Wei C, Gu J. Giải mã khả năng di căn và liệu pháp bổ trợ sau phẫu thuật tối ưu cho khối u ác tính dựa trên điểm di căn. Tế bào chết Discov. 2023 Tháng Mười 25;9(1):397. doi: 10.1038/s41420-023-01678-6. (NẾU NHƯ:7.0)
Sản phẩm liên quan
| Tên sản phẩm | Con mèo# | Đặc điểm kỹ thuật |
| Ciprofloxacin hydroclorid | 60201ES05/25/60 | 5/25/100g |
| Ampicillin, Muối Natri | 60203ES10/60 | 10/100g |
| Doxycycline hyclate | 60204ES03/08/25 | 1/5/25g |
| Cloramphenicol, Cấp độ USP | 60205ES08/25/60 | 5/25/100g |
| Kanamycin sulfat | 60206ES10/60 | 10/100g |
| Tetracyclin HCl Tetracycline hydrochloride (USP) | 60212ES25/60 | 25/100g |
| Vancomycin Hydrochloride | 60213ES60/80/90 | 100mg/1g/5g |
| Muối Gentamycin Sulfate | 60214ES03/08/25 | 1/5/25g |
| Spectinomycin Hydrochloride | 60215ES08 | 5g |
| Phleomycin (20 mg/mL trong dung dịch) | 60217ES20/60 | 20/5×20mg |
| Thuốc Blasticidin S (Blasticidin) | 60218ES10/60 | 10/10×10mg |
| Nystatin | 60219ES08 | 5g |
| G418 Sulfate (Geneticin) | 60220ES03/08 | 1/5g |
| Puromycin (Dung dịch 10 mg/mL) | 60209ES10/50/60/76 | 1×1 /5 ×1 / 1 0 ×1 /50 ×1 mL |
| Puromycin Dihydrochloride | 60210ES25/60/72/76/80 | 25/100/250/500mg / 1g |
| Hygromycin B (50 mg/mL) | 60224ES03 | 1 g (20 mL)/10×1 g (20 mL) |
| Hygromycin B | 60225ES03/10 | 1/10g |
| Thuốc Erythromycin | 60228ES08/25 | 5/25g |
| Thời gian | 60230ES07/32 | 3.2/10×3.2g |
| Aureobasidin A (AbA) | 60231ES03/08/10 | 1/5×1/10×1mg |
| Polymyxin B sulfat | 60242ES03/10 | 1/10MU |