Khi nghiên cứu y khoa tiếp tục tiến triển, liệu pháp nhắm mục tiêu đã trở nên hoàn thiện hơn. Tiền đề của liệu pháp nhắm mục tiêu là thực hiện xét nghiệm di truyền trên các mục tiêu phân tử của thuốc để xác định đột biến gen gây ra các rối loạn di truyền hoặc ác tính. ARMS-PCR là một phương pháp mới dựa trên PCR có thể phát hiện nhiều đột biến điểm DNA. Hiện nay, đây là một trong những phương pháp thiết yếu và phổ biến nhất để xác định di truyền tùy chỉnh các bệnh ung thư. Các chuyên gia trong lĩnh vực này đã công nhận lợi ích của việc sử dụng liệu pháp này.

1. PCR đặc hiệu alen hoạt động như thế nào?
2. Làm thế nào để cải thiện tính đặc hiệu của ARMS?
3. Các tính năng của sản phẩm được cung cấp bởi Yeasen?
4. Dữ liệu hiệu suất sản phẩm là gì?
5. Mọi người đặt hàng sản phẩm như thế nào?

1. PCR đặc hiệu alen hoạt động như thế nào?

ARMS-PCR là Hệ thống PCR đột biến kháng khuếch đại (ARMS-PCR), còn được gọi là PCR đặc hiệu alen (AS-PCR). Phần mở rộng đặc hiệu alen được điều chỉnh để xác định alen kiểu hoang dã và gen kiểu hoang dã đột biến, và giá trị tín hiệu huỳnh quang được đo bằng kỹ thuật thăm dò Taqman.
Các đoạn mồi ARMS PCR được thiết kế với các nucleotide khác nhau ở đầu 3' của hai đoạn mồi thượng nguồn của alen và hai đoạn mồi này lần lượt đặc hiệu cho kiểu hoang dã và kiểu đột biến. Trong quá trình khuếch đại, các đoạn mồi thượng nguồn không khớp hoàn toàn với khuôn mẫu không thể tạo thành các cặp bazơ bổ sung, dẫn đến sự không khớp, cản trở quá trình mở rộng và không thể tạo ra các sản phẩm PCR, trong khi các hệ thống đoạn mồi khớp với khuôn mẫu có thể khuếch đại các sản phẩm PCR tương ứng. Chất huỳnh quang trên đầu dò Taqman có thể phát ra tín hiệu huỳnh quang có thể được thiết bị phát hiện và kiểu gen có thể được xác nhận bằng cách đánh giá dữ liệu huỳnh quang.
Công nghệ ARMS có độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đạt 100 bản sao/mL và giới hạn phát hiện đối với mô khối u có thể đạt tỷ lệ đột biến 0,5%. Ngoài ra, ARMS tốn nhiều thời gian và chi phí thấp, kết quả trực quan và dễ đánh giá. Điều này là do ARMS kết hợp với công nghệ qPCR hoặc điện di chỉ cần một phản ứng PCR, mất ít thời gian hơn. Chỉ cần tối ưu hóa các đoạn mồi thượng nguồn cho công nghệ ARMS, có chi phí thấp hơn và kết quả trực quan hơn so với công nghệ PCR thời gian thực sử dụng đầu dò MGB. Vì hầu hết DNA được chiết xuất từ ​​các mẫu mô nhúng parafin bị phân mảnh nên không thể thu được kết quả phát hiện chính xác. Phương pháp ARMS được thiết kế để giảm thiểu chiều dài của sản phẩm mục tiêu, do đó giải quyết được khó khăn này trong mô nhúng parafin. Đồng thời, ARMS kết hợp với nền tảng PCR thực hiện hoạt động ống kín, dễ vận hành và không yêu cầu xử lý sản phẩm sau, do đó tránh được tình trạng nhiễm bẩn các sản phẩm khuếch đại ở mức độ lớn nhất.
Về mặt lý thuyết, Taq DNA polymerase phải bổ sung đầy đủ cho khuôn mẫu còn lại ở đầu 3' của đoạn mồi để thực hiện quá trình trùng hợp hiệu quả. Tuy nhiên, tính nghiêm ngặt của Taq DNA bị ảnh hưởng bởi một số yếu tố. Trong một số trường hợp, quá trình kéo dài có thể diễn ra ngay cả khi bazơ đầu cuối 3' của đoạn mồi không bổ sung cho khuôn mẫu. Nếu chỉ có một sự không khớp bazơ ở đầu 3', các đoạn mồi có thể không khớp và được kéo dài, nhưng hiệu quả kéo dài thấp. Các vị trí lệch đầu 3' khác nhau có hiệu quả kéo dài khác nhau. Nếu các bazơ không khớp khác được đưa vào đầu 3', số lượng các sự không khớp quá lớn và đầu 3' không thể được kéo dài sau một mức nhất định.Do đó, chỉ một sự không khớp bazơ ở đầu 3' của đoạn mồi không thể phân biệt đầy đủ hai alen, dẫn đến kết quả dương tính giả.

2. Làm thế nào để cải thiện tính đặc hiệu của ARMS?

Trọng tâm của việc cải thiện tính đặc hiệu của ARMS là cải thiện tính đặc hiệu mở rộng của mồi. Một bazơ không khớp có thể được đưa vào ở bazơ thứ 2 hoặc thứ 3 từ đầu 3'. Các bazơ không khớp hoạt động cùng với các bazơ không khớp ở đầu 3' và trong khuôn mẫu không bổ sung cho đầu 3', tốc độ sản phẩm khuếch đại của mồi bị giảm. Trong khi các mồi khuếch đại bình thường trong các khuôn mẫu bổ sung cho đầu 3' của chúng, loại bazơ không khớp của mồi phụ thuộc vào loại không khớp bazơ ở đầu 3'.
Sau khi các đoạn mồi đặc hiệu cho ARMS được thiết kế, cần có một cặp đầu dò TaqMan để truyền năng lượng cộng hưởng huỳnh quang đặc hiệu alen. Đầu dò TaqMan có hai thuốc nhuộm huỳnh quang, đầu 5' là gen huỳnh quang và đầu 3' có gen dập tắt huỳnh quang chung. Trong một đầu dò hoàn chỉnh, gen dập tắt và gen sinh huỳnh quang nằm rất gần nhau về mặt không gian, dẫn đến dập tắt huỳnh quang. Trong những trường hợp bình thường, huỳnh quang phát ra bởi chất huỳnh quang ở đầu 5' không thể được phát hiện và chỉ có thể phát hiện huỳnh quang nền của chất dập tắt ở đầu 3'. Trong quá trình khuếch đại gen mục tiêu, cả các đoạn mồi PCR và đầu dò được gắn huỳnh quang sẽ bổ sung cho trình tự mục tiêu trong quá trình khử OR. Khi enzyme Taq gặp một đầu dò liên kết ổn định với khuôn mẫu khi kéo dài chuỗi khuôn mẫu, exonuclease 5'-3' của enzyme Taq sẽ phân hủy đầu dò đặc hiệu liên kết với khuôn mẫu. Chất huỳnh quang trên đầu dò được tách ra bởi không gian vật lý, hiệu ứng dập tắt biến mất và huỳnh quang được phát ra. Sự không khớp giữa các đầu dò huỳnh quang yếu và trình tự mục tiêu sẽ làm giảm lượng huỳnh quang được giải phóng.

Hình 1 Khái niệm cơ bản của ARMS-PCR

3. Các tính năng của sản phẩm được cung cấp bởi Yeasen?

Yeasen Hieff Unicon™ Multiplex ARMS qPCR Mix là bộ dụng cụ dựa trên khái niệm khối khuếch đại cho phép phân tích kiểu gen hiệu quả thông qua trung gian ARMS-PCR.

👍Độ chọn lọc cao: có thể xác định được nhiều đột biến gen
👍Độ nhạy cao: các đoạn mồi đột biến có thể phát hiện đột biến ở nồng độ thấp tới 0,5% trong 10ng/L DNA;
👍Dễ đọc: Kết quả rõ ràng và được đánh giá một cách khách quan và nó là đơn giản và dễ hiểu;
👍Dễ vận hành: Tương thích với nhiều loại thiết bị PCR, chế độ vận hành được chuẩn hóa và việc phát hiện trên máy có thể hoàn thành trong 90 phút.

4. Dữ liệu hiệu suất sản phẩm là gì?

4.1 Tác động chặn sản phẩm vượt trội

Thí nghiệm: 5L mẫu đầu vào, 10ng/L mẫu kiểu hoang dã và lượng plasmid đột biến tương đương được khuếch đại bằng cách sử dụng các đoạn mồi đột biến
Địa điểm：KRASG13D（38G>A）
Đỏ：13755；Xanh lam: Đối thủ cạnh tranh

Hình 2 chứng minh rằng các đoạn mồi kiểu hoang dã khuếch đại cả mẫu kiểu hoang dã và đột biến. Theo đường cong khuếch đại, mẫu kiểu hoang dã không có đỉnh hoặc sự khác biệt về giá trị Ct giữa kiểu hoang dã và đột biến là 6-8, cho phép phân biệt hiệu quả các gen kiểu hoang dã và đột biến.

4.2 Tỷ lệ phát hiện sản phẩm có thể đạt 0,05%

Thí nghiệm 1: Kỹ thuật chuẩn bị chuẩn tự trộn (50%): 50μL DNA kiểu hoang dã 10ng/μL và 50μL bản sao 3X103 của plasmid đột biến.
Địa điểm：KRASG13D(38G>A)

Hình 3. Theo đường cong khuếch đại, sản phẩm tiếp tục hoạt động hiệu quả ở nồng độ 0,05%

Thí nghiệm 2: Chuẩn 5% đã mua (50ng/μL) được pha loãng với chất pha loãng thư viện thành 10ng/μL, sau đó pha loãng thêm với 10ng/μL DNA 293g thành 0,1% và 0,05%.
Địa điểm：L858R
Đỏ：13755；Xanh lam: Đối thủ cạnh tranh

Hình 4: Theo đường cong khuếch đại, tỷ lệ phát hiện các locus trên nền gDNA kiểu hoang dã là 10ng/μL có thể lên tới 0,05% và quá trình xác nhận tiếp theo theo các tiêu chuẩn thương mại chứng minh rằng sản phẩm của chúng tôi có tỷ lệ phát hiện tuyệt vời.

4.3 Độ ổn định sản phẩm tuyệt vời

Hiệu ứng khuếch đại và ngăn chặn của sản phẩm không bị ảnh hưởng bởi 10 chu kỳ đông lạnh và rã đông.
Thí nghiệm: đỏ: -20℃; xanh lá cây: đông lạnh-tan băng thực sự 5 lần; xanh dương: đông lạnh-tan băng thực sự 8 lần; tím: đông lạnh-tan băng thực sự 10 lần.
Địa điểm：L858R

Hình 5 chứng minh rằng việc đông lạnh và rã đông thuốc thử 13755 nhiều lần không ảnh hưởng đến khả năng khuếch đại và đặc tính ngăn chặn của thuốc thử này.

Hiệu ứng khuếch đại và ngăn chặn của nó không bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ 37 °C trong 7 ngày.
Thí nghiệm: Đỏ: -20°C; Xanh lá cây và Tím: 37°C trong 7 ngày.
Địa điểm：L858R

Hình 6 chứng minh rằng bảy ngày ở nhiệt độ 37°C không ảnh hưởng đến hoạt động khuếch đại và ngăn chặn của thuốc thử 13755.

5. Mọi người đặt hàng sản phẩm như thế nào?

Yeasen Công ty TNHH Công nghệ sinh học (Thượng Hải), được thành lập vào năm 2014, là một doanh nghiệp công nghệ cao tham gia vào hoạt động R & D và sản xuất nguyên liệu enzyme công cụ và kháng thể kháng nguyên. Các sản phẩm của công ty bao gồm enzyme chẩn đoán phân tử, protein và kháng thể được sử dụng trong dược phẩm, thử nghiệm an toàn thực phẩm, chăn nuôi, tư pháp và các ngành công nghiệp khác. Chúng tôi cam kết cung cấp cho khách hàng trong lĩnh vực khoa học sự sống các sản phẩm và dịch vụ chất lượng cao. Các sản phẩm Yeasen có thể cung cấp như sau:

Bảng 1: Sản phẩm được cung cấp bởi Yeasen