Giá trị Ct là một biểu diễn kết quả quan trọng trong PCR định lượng huỳnh quang. Nó được sử dụng để tính toán sự khác biệt trong mức độ biểu hiện gen hoặc số lượng bản sao gen. Vậy, phạm vi giá trị Ct nào có thể được coi là hợp lý trong định lượng huỳnh quang? Làm thế nào chúng ta có thể đảm bảo rằng các giá trị Ct nằm trong phạm vi hiệu quả? Hôm nay, hãy để Xiao Yi trả lời câu hỏi này cho mọi người.
Giá trị Ct là gì?
Trong quá trình khuếch đại qPCR, giá trị Ct đề cập đến số chu kỳ khuếch đại (Ngưỡng Chu kỳ) mà tại đó tín hiệu huỳnh quang của sản phẩm được khuếch đại đạt đến ngưỡng huỳnh quang đã đặt. "C" là viết tắt của Chu kỳ, và "T" là viết tắt của Ngưỡng. Nói một cách đơn giản, giá trị Ct là số chu kỳ cần thiết để khuôn mẫu bắt đầu trong qPCR đạt đến một lượng sản phẩm nhất định, điều này sẽ được giải thích thêm sau.
Chức năng của giá trị Ct là gì?
1. Mối quan hệ giữa khuếch đại mũ, số lượng mẫu và giá trị Ct
Trong một kịch bản lý tưởng, trong qPCR, các gen được khuếch đại theo cấp số nhân và tích lũy qua một số chu kỳ nhất định. Mối quan hệ giữa số chu kỳ khuếch đại và lượng sản phẩm có thể được biểu thị như sau: lượng sản phẩm được khuếch đại = lượng mẫu ban đầu×(1 + En)^số chu kỳ. Tuy nhiên, phản ứng qPCR không phải lúc nào cũng xảy ra trong điều kiện lý tưởng. Khi lượng sản phẩm được khuếch đại đạt đến "lượng sản phẩm nhất định", số chu kỳ tại thời điểm này là giá trị Ct, biểu thị giai đoạn khuếch đại theo cấp số nhân. Mối quan hệ giữa giá trị Ct và lượng mẫu ban đầu như sau: có một mối quan hệ tuyến tính giữa giá trị Ct của mẫu và logarit của số bản sao ban đầu của mẫu đó. Nồng độ mẫu ban đầu cao hơn dẫn đến giá trị Ct thấp hơn, trong khi nồng độ mẫu ban đầu thấp hơn dẫn đến giá trị Ct cao hơn.
2. Đường cong khuếch đại, ngưỡng huỳnh quang và số lượng sản phẩm nhất định
Lượng sản phẩm khuếch đại qPCR được biểu diễn trực tiếp dưới dạng tín hiệu huỳnh quang, được gọi là đường cong khuếch đại. Trong giai đoạn đầu của PCR, khi khuếch đại ở điều kiện lý tưởng và số chu kỳ thấp, sự tích tụ sản phẩm là tối thiểu và mức độ huỳnh quang được tạo ra không thể phân biệt đáng kể với nhiễu huỳnh quang nền. Sau đó, quá trình sản xuất huỳnh quang đi vào pha mũ. Lượng sản phẩm PCR có thể được phát hiện tại một thời điểm nhất định khi phản ứng vừa bước vào pha mũ, được gọi là "lượng sản phẩm nhất định". Điều này có thể được sử dụng để suy ra hàm lượng ban đầu của khuôn mẫu. Do đó, cường độ tín hiệu huỳnh quang tương ứng với lượng sản phẩm nhất định được gọi là ngưỡng huỳnh quang.
Ở giai đoạn sau của PCR, đường cong khuếch đại không còn biểu hiện khuếch đại theo cấp số nhân nữa mà chuyển sang pha tuyến tính và pha ổn định.
3. Khả năng tái tạo giá trị Ct
Khi các chu kỳ PCR đạt đến số chu kỳ mà giá trị Ct xuất hiện, nó chỉ mới bước vào giai đoạn khuếch đại theo hàm mũ thực sự. Tại thời điểm này, các lỗi nhỏ chưa được khuếch đại, do đó khả năng tái tạo các giá trị Ct là tuyệt vời. Điều này có nghĩa là cho dù cùng một khuôn mẫu được khuếch đại tại các thời điểm khác nhau hoặc trong các ống khác nhau cùng một lúc, các giá trị Ct thu được vẫn không đổi.
Phạm vi giá trị Ct là bao nhiêu?
1. Hiệu suất khuếch đại En
Hiệu quả khuếch đại PCR đề cập đến hiệu quả mà polymerase chuyển đổi gen mục tiêu thành sản phẩm khuếch đại.Hiệu suất khuếch đại là 100% khi một phân tử DNA được chuyển đổi thành hai phân tử DNA. Hiệu suất khuếch đại thường được ký hiệu là En. Để thuận tiện cho việc phân tích trong các bài viết tiếp theo, sau đây là phần giới thiệu ngắn gọn về các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu suất khuếch đại.
| Các yếu tố ảnh hưởng | Giải thích | Phán quyết |
| A. Chất ức chế PCR | 1. RNA khuôn mẫu có thể chứa các chất ức chế phản ứng PCR, chẳng hạn như protein hoặc chất tẩy rửa, cùng nhiều chất khác. 2. cDNA thu được sau phiên mã ngược có thể chứa nồng độ cao RNA khuôn mẫu và các thành phần của thuốc thử phiên mã ngược, điều này cũng có thể ức chế PCR tiếp theo. | 1. Sự hiện diện của ô nhiễm có thể được đánh giá bằng cách đo tỷ lệ A260/A280 và A260/A230 hoặc bằng cách thực hiện điện di RNA. 2. Sau khi phiên mã ngược, cDNA có được pha loãng theo một tỷ lệ nhất định hay không. |
| B. Thiết kế mồi không hợp lý | Sơn lót không thể ủ hiệu quả. | Kiểm tra xem có cấu trúc dimer hay kẹp tóc trong đoạn mồi hay không và xem có sự không khớp nào không; đôi khi cần phải chú ý đến thiết kế kéo dài các intron. |
| C. Quy trình phản ứng không phù hợp | 1. Các lớp mồi không thể gắn kết hiệu quả. 2. Hoạt động của ADN polymerase không được giải phóng hoàn toàn. 3. Do nhiệt độ cao kéo dài, hoạt động của ADN polymerase giảm. | 1. Nhiệt độ gắn cao hơn giá trị Tm của mồi. 2. Thời gian biến tính trước quá ngắn. 3. Thời gian của từng giai đoạn trong quy trình phản ứng quá dài. |
| D. Thuốc thử không được trộn đều hoặc lỗi hút | Trong hệ thống phản ứng, nồng độ cục bộ của các thành phần phản ứng PCR quá cao hoặc không đồng đều, dẫn đến sự khuếch đại PCR không theo cấp số nhân. | / |
| E. Chiều dài Amplicon | Chiều dài đoạn khuếch đại quá dài, vượt quá 300 cặp bazơ, dẫn đến hiệu suất khuếch đại thấp. | Kiểm tra xem độ dài đoạn khuếch đại có nằm trong khoảng từ 80 cặp bazơ đến 300 cặp bazơ hay không. |
| F. Tác động của thuốc thử qPCR | Nồng độ DNA polymerase trong thuốc thử thấp hơn hoặc nồng độ ion trong dung dịch đệm không tối ưu sẽ khiến enzyme Taq không đạt được hoạt động tối đa. | Đường cong chuẩn được sử dụng để đo hiệu quả khuếch đại của các đoạn mồi. |
2. Phạm vi giá trị Ct
Phạm vi giá trị Ct là 15-35. Giá trị Ct nhỏ hơn 15 được coi là nằm trong pha cơ sở và chưa đạt ngưỡng huỳnh quang. Lý tưởng nhất là có mối quan hệ tuyến tính giữa giá trị Ct và logarit của số bản sao ban đầu của mẫu, được gọi là đường cong chuẩn. Sử dụng đường cong chuẩn, khi hiệu suất khuếch đại là 100%, giá trị Ct để định lượng một bản sao duy nhất của gen được tính là khoảng 35. Nếu giá trị Ct lớn hơn 35, về mặt lý thuyết, số bản sao ban đầu của mẫu nhỏ hơn 1, có thể được coi là không đáng kể về mặt thống kê.
Đối với các gen khác nhau, phạm vi giá trị Ct, do sự thay đổi về số lượng bản sao gen ban đầu và hiệu quả khuếch đại, đòi hỏi phải tạo đường cong chuẩn cho gen đó để tính toán phạm vi phát hiện tuyến tính của gen.
3.Các yếu tố ảnh hưởng đến giá trị Ct
Như được chỉ ra bởi mối quan hệ giữa số chu kỳ khuếch đại và lượng sản phẩm: Lượng sản phẩm khuếch đại = Lượng mẫu ban đầu × (1 + En)^số chu kỳ, có thể thấy rằng trong điều kiện lý tưởng, lượng mẫu ban đầu và En sẽ tác động đến giá trị Ct. Sự khác biệt về chất lượng mẫu hoặc hiệu suất khuếch đại có thể khiến giá trị Ct quá cao hoặc quá thấp.
4. Giá trị Ct quá cao hoặc quá thấp
Xiao Yi đã tham khảo ý kiến của các chuyên gia trong bộ phận kỹ thuật của công ty chúng tôi và tóm tắt nguyên nhân và giải pháp cho hai loại sự cố phổ biến liên quan đến giá trị Ct để giúp độc giả hiểu rõ hơn.
| Vấn đề | Nguyên nhân | Giải pháp |
| Giá trị Ct quá cao | Nồng độ mẫu thấp hoặc có chất ức chế PCR. Hiệu suất khuếch đại thấp. | 1. Tăng nồng độ khuôn mẫu; hoặc tăng tỷ lệ pha loãng của RNA hoặc cDNA; hoặc chuẩn bị lại khuôn mẫu. 2. Giảm nhiệt độ ủ hoặc sử dụng phương pháp khuếch đại hai bước; đảm bảo các thành phần và hệ thống được trộn đều; tối ưu hóa giao thức phản ứng hoặc thử thay thế thuốc thử. |
| Giá trị Ct quá thấp | 1. Nồng độ mẫu cao 2. Nhiễm bẩn trong NTC (Không kiểm soát mẫu) và NRC (Không kiểm soát ngược) 3. Thiết kế lớp sơn lót không phù hợp | 1. Giảm lượng RNA mẫu; hoặc pha loãng cDNA theo tỷ lệ cao hơn. 2. Thay thế toàn bộ thuốc thử mới hoặc sử dụng thuốc thử chống nhiễm bẩn UDGase. 3. Tối ưu hóa quy trình để tránh khuếch đại không đặc hiệu. |
Như vậy là kết thúc quá trình phân tích các nguyên nhân gây ra giá trị Ct bất thường cho vấn đề này. Tiếp theo, Xiao Yi sẽ đề xuất một loạt các sản phẩm tiết kiệm chi phí để đảm bảo dữ liệu thử nghiệm của bạn chính xác và đáng tin cậy hơn. Hãy đến và chọn sản phẩm yêu thích của bạn!
| Tên sản phẩm | Con mèo# | Kích cỡ |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 mL |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix cho qPCR (máy tiêu hóa gDNA cộng thêm) | 11141ES60 | 100 tấn |
| Hifair™ AdvanceFast Một bước RT-gDNA Digestion SuperMix cho qPCR | 11151ES60 | 100 tấn |
| Bộ tổng hợp cDNA sợi 1 Hifair™ AdvanceFast (Không nhuộm) | 11150ES60 | 100 tấn |