PCR định lượng huỳnh quang (qPCR) là một kỹ thuật thường được sử dụng trong các phòng thí nghiệm, có thể áp dụng cho phân tích biểu hiện gen, phân tích kiểu gen, phát hiện tác nhân gây bệnh, phân tích SNP, v.v. Hoạt động của qPCR rất đơn giản và nguyên lý của nó rất dễ hiểu. Bây giờ, khi đối mặt với một đống dữ liệu lộn xộn, cách phân tích kết quả trở thành một nhiệm vụ khó khăn. Hôm nay, Xiao Yi sẽ hướng dẫn bạn cách đơn giản hóa các quy trình phức tạp và dễ dàng có được dữ liệu có thể được công bố trên các tạp chí SCI!
Các phương pháp phân tích phổ biến được sử dụng trong qPCR bao gồm định lượng tương đối và định lượng tuyệt đối, và việc lựa chọn giữa các phương pháp này phải dựa trên các thiết kế thử nghiệm khác nhau. Trong số này, chúng tôi sẽ tập trung vào một ứng dụng phổ biến của qPCR——phân tích biểu hiện gen, trong đó phương pháp định lượng tương đối thường được lựa chọn.
Thiết kế thử nghiệm
Giả sử hiện tại chúng ta cần nghiên cứu tác động của cảm ứng ánh sáng lên biểu hiện của gen AtSUC2 của Arabidopsis. Nhóm đối chứng sẽ bao gồm các cây Arabidopsis chưa trải qua bất kỳ xử lý nào, trong khi nhóm thử nghiệm sẽ là các cây đã được xử lý bằng một loại cảm ứng ánh sáng nhất định. RNA sẽ được chiết xuất từ cả hai nhóm và phiên mã ngược để thu được cDNA, sau đó sẽ được sử dụng làm khuôn mẫu. Gen GAPDH của Arabidopsis sẽ được chọn làm tham chiếu nội bộ cho thí nghiệm qPCR.
Các giếng qPCR cần được thiết lập như sau:
1) NTC (Không có mẫu kiểm soát) được sử dụng để xác minh xem có sự nhiễm bẩn trong hệ thống PCR hay không.
2) NRT (Không có phiên mã ngược) là sử dụng RNA chưa trải qua phiên mã ngược làm khuôn mẫu, đóng vai trò kiểm soát sự nhiễm gDNA.
3) Các gen tham chiếu nội bộ được sử dụng để hiệu chỉnh những khác biệt gây ra bởi sự thay đổi nồng độ ban đầu của mẫu.
4) Việc lựa chọn mẫu kiểm soát nói chung thuộc vào các loại sau:
- Để đánh giá tác động của một phương pháp xử lý nhất định lên biểu hiện gen, mẫu chưa xử lý sẽ được sử dụng làm mẫu tham chiếu.
- Để phát hiện sự khác biệt trong biểu hiện gen tại các thời điểm khác nhau, mẫu tại thời điểm 0 được sử dụng làm mẫu tham chiếu.
- Để so sánh sự khác biệt trong biểu hiện gen giữa các mô khác nhau, một mô được chọn ngẫu nhiên làm mẫu tham chiếu.
Một điểm cần lưu ý ở đây là đối với mỗi vật liệu được đề cập ở trên, 3 giếng PCR (1, 2, 3) đã được thiết lập. Đây là các bản sao PCR, còn được gọi là bản sao kỹ thuật, nhằm mục đích loại bỏ các lỗi vận hành và đánh giá chính xác hiệu quả khuếch đại. Ngoài ra, cần thiết lập các bản sao sinh học, bao gồm việc tiến hành cùng một thí nghiệm trên các vật liệu khác nhau (thời gian, cây, lô, đĩa phản ứng khác nhau) để hiệu chỉnh biến thiên sinh học và phân tích xem phương pháp xử lý có ý nghĩa thống kê hay không. Cụ thể trong trường hợp này, cả nhóm thử nghiệm và nhóm đối chứng đều cần xử lý ít nhất hai bộ mẫu Arabidopsis (A, B, C). RNA được chiết xuất từ mỗi bộ và phiên mã ngược, sau đó là qPCR. Đối với phân tích thống kê, giá trị trung bình của ba bản sao sinh học được sử dụng.
Phân tích kết quả — Phương pháp ΔΔCt
Đặc điểm của phương pháp ΔΔCt là chỉ dựa vào giá trị Ct để tính toán, nhưng tiền đề là hiệu quả khuếch đại của gen mục tiêu và gen tham chiếu phải tương đối nhất quán và đều nằm trong khoảng 90-110%.
Công thức tính toán cụ thể như sau:
ΔCt = Ct (gen mục tiêu) - Ct (gen tham chiếu)
ΔΔCt = ΔCt (nhóm thử nghiệm) - ΔCt (nhóm đối chứng)
RQ = 2^(-ΔΔCt)
Giả sử thí nghiệm trên nghiên cứu tác động của cảm ứng ánh sáng lên quá trình biểu hiện gen AtSUC2 của Arabidopsis, kết quả của qPCR như sau:
Trong quá trình tính toán, trước tiên chúng tôi tính giá trị trung bình của dữ liệu 2^-△Ct cho nhóm đối chứng (như thể hiện trong hình trên, là 0,00116). Sau đó, chúng tôi chia mỗi giá trị 2^-△Ct cho giá trị trung bình này để thu được giá trị 2^-△△Ct. Cuối cùng, chúng tôi sắp xếp các giá trị này để thu được giá trị trung bình và độ lệch chuẩn, cho thấy mức độ biểu hiện của gen mục tiêu trong nhóm thử nghiệm tăng khoảng 9,73 lần so với nhóm đối chứng.
Kết quả được biểu diễn bằng phần mềm Graphpad như sau:
Giá trị P được tính toán bằng kiểm định t của phần mềm là 0,0024, nhỏ hơn 0,05, cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê và kết quả đáng tin cậy.
Phân tích kết quả — Phương pháp đường cong chuẩn kép
Trong ứng dụng thực tế, vì hiệu suất khuếch đại của gen mục tiêu và gen tham chiếu thường khác nhau nên cần thiết kế lại các đoạn mồi và tối ưu hóa các điều kiện phản ứng để đạt được hiệu suất khuếch đại như nhau. Tuy nhiên, chúng ta cũng có thể chọn một phương pháp thuận tiện hơn, đó là phương pháp đường cong chuẩn kép.
Ở đây, trước tiên chúng ta hãy tìm hiểu phương pháp phân tích định lượng tuyệt đối. Các bước cụ thể là khuếch đại đoạn mục tiêu thông qua PCR, sau đó đưa đoạn mục tiêu vào vectơ nhân bản, trích xuất plasmid tái tổ hợp và sau khi giải trình tự xác nhận là chính xác, có thể sử dụng plasmid này làm chuẩn. Lượng DNA plasmid có thể được đo bằng các thiết bị như Nanodrop và số bản sao được chuyển đổi thành các bản sao plasmid cụ thể bằng công thức chuyển đổi số bản sao. Sau đó, DNA được khuếch đại theo một loạt các pha loãng. Đường cong chuẩn được vẽ với logarit của số bản sao chuẩn là trục x và các giá trị Ct đo được là trục y. Dựa trên giá trị Ct của mẫu chưa biết, có thể tính toán số bản sao tuyệt đối của mẫu đó.
Sao chép công thức tính số:
Số bản sao = (khối lượng ÷ khối lượng phân tử tương đối) × 6,02 × 10^23
Phương pháp đường cong chuẩn kép bao gồm việc xây dựng riêng các mẫu chuẩn cho gen mục tiêu và gen tham chiếu, thực hiện định lượng tuyệt đối và tạo đường cong chuẩn. Sau khi tính toán số bản sao tuyệt đối của các mẫu chưa biết, một phép so sánh được thực hiện, do đó cung cấp độ chính xác cao hơn.
Công thức tính toán cụ thể như sau:
Q = Số bản sao gen mục tiêu / Số bản sao gen tham chiếu
RQ = Q (thử nghiệm) / Q (kiểm soát)
Trong thí nghiệm được đề cập ở trên, nhằm nghiên cứu tác động của cảm ứng ánh sáng lên quá trình biểu hiện gen AtSUC2 của Arabidopsis, các mẫu chuẩn cho cả AtSUC2 và GAPDH đã được xây dựng và các đường cong chuẩn sau đây đã được chuẩn bị:
Giá trị Ct cho gen mục tiêu và gen tham chiếu nội bộ trong các mẫu cần thử nghiệm như sau:
Trong quá trình tính toán, trước tiên, các giá trị Ct của gen mục tiêu và gen tham chiếu nội bộ được thay thế vào mối quan hệ tuyến tính của đường cong chuẩn để có được số bản sao tuyệt đối của gen mục tiêu và gen tham chiếu nội bộ trong cả nhóm thử nghiệm và nhóm đối chứng. Sau đó, sử dụng công thức Q = số bản sao gen mục tiêu / số bản sao gen tham chiếu, mức độ biểu hiện của gen mục tiêu được chuẩn hóa.Cuối cùng, theo công thức RQ = Q (thử nghiệm) / Q (đối chứng), RQ được tính là 9,71, điều này cho thấy mức độ biểu hiện của gen mục tiêu ở nhóm thử nghiệm cao hơn nhóm đối chứng 9,71 lần.
Kết quả được biểu diễn bằng phần mềm GraphPad như sau:
Giá trị P được tính toán bằng kiểm định t của phần mềm là 0,0008, nhỏ hơn 0,05, cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê và kết quả đáng tin cậy.
Như vậy là kết thúc phần phân tích dữ liệu qPCR cho phiên này. Tiếp theo, tôi sẽ đề xuất một loạt các sản phẩm tiết kiệm chi phí để đảm bảo dữ liệu thử nghiệm của bạn chính xác và đáng tin cậy hơn. Hãy đến và chọn chúng!
| Tên sản phẩm | Con mèo# | Kích cỡ |
| Hieff UNICON™ Universal Blue qPCR SYBR Green Master Mix | 11184ES08 | 5×1 mL |
| Hifair™ Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix cho qPCR (máy tiêu hóa gDNA cộng thêm) | 11141ES60 | 100 tấn |
| Hifair™ AdvanceFast Một bước RT-gDNA Digestion SuperMix cho qPCR | 11151ES60 | 100 tấn |
| Bộ tổng hợp cDNA sợi 1 Hifair™ AdvanceFast (Không nhuộm) | 11150ES60 | 100 tấn |