Chiều dài của miRNA trưởng thành chỉ khoảng 20nt, thông thường, đoạn mồi xuôi sẽ bao phủ toàn bộ chiều dài của nó hoặc thậm chí có một phần thừa, và đoạn mồi ngược sẽ không có chỗ để đặt. Giải pháp thị trường hiện tại là tăng chiều dài của bản sao ngược trong quá trình phiên mã ngược. Các phương pháp phổ biến bao gồm phương pháp đuôi và phương pháp vòng gốc.

1. Giới thiệu
2. Sản phẩm được đề xuất
3. Danh sách sản phẩm liên quan

1. Giới thiệu

MicroRNA (miRNA) là RNA nhỏ mạch đơn có kích thước khoảng 21-23 bazơ, được tạo ra từ tiền chất RNA mạch đơn có cấu trúc kẹp tóc khoảng 70-90 bazơ sau quá trình xử lý enzyme Dicer. miRNA chủ yếu liên kết đặc hiệu với vùng không mã hóa đầu 3' của mRNA gen đích và điều chỉnh quá trình dịch mã của mRNA gen đích sau phiên mã, do đó ngăn chặn quá trình dịch mã mRNA và thúc đẩy quá trình phân hủy mRNA, dẫn đến giảm biểu hiện protein. Vai trò của miRNA liên quan đến sự xuất hiện và phát triển của nhiều bệnh tim mạch như phát sinh, biệt hóa mô, tăng sinh tế bào và apoptosis.

Hình 1. Sơ đồ tổng hợp miRNA trong cơ thể sống

Chiều dài của miRNA trưởng thành chỉ khoảng 20nt, thông thường, đoạn mồi xuôi sẽ bao phủ toàn bộ chiều dài của nó hoặc thậm chí có một phần thừa, và đoạn mồi ngược sẽ không có chỗ để đặt. Giải pháp thị trường hiện tại là tăng chiều dài của bản sao ngược trong quá trình phiên mã ngược. Các phương pháp phổ biến bao gồm phương pháp đuôi và phương pháp vòng gốc.

Hình 2. Tổng hợp miRNA bằng phương pháp kéo đuôi

Hình 3. Tổng hợp miRNA bằng phương pháp vòng gốc

Phương pháp gắn đuôi sử dụng PolyA polymerase để thêm đuôi Poly(A) vào miRNA trưởng thành và sử dụng Oligo-dT với trình tự phổ quát làm mồi phiên mã ngược để tổng hợp miRNA dài tương ứng với mạch đầu tiên của cDNA. Phương pháp vòng gốc sử dụng trình tự phổ quát gấp vào cấu trúc vòng gốc làm mồi để tổng hợp mạch đầu tiên của cDNA tương ứng với miRNA dài. Cấu trúc vòng gốc sẽ được mở ở nhiệt độ thích hợp trong quá trình khuếch đại tiếp theo và kết hợp với các đoạn mồi khuếch đại có liên quan.

Bảng 1.So sánh Tailing và Stem-loop

2. Sản phẩm được đề xuất

2.1 Yeasen Kết hợp định lượng đảo ngược đuôi miRNA (11148ES&11171ES)

Hình 4. Bộ tổng hợp cDNA sợi 11148ES-Hifair™ miRNA

Bộ dụng cụ này áp dụng phương pháp gắn đuôi để đảo ngược phiên mã cDNA sợi đầu tiên của miRNA. Bộ đệm RT miRNA 2×Hifair™ trong sản phẩm chứa tất cả các nguyên liệu thô và mồi cho phản ứng gắn đuôi miRNA và phản ứng phiên mã ngược, và đã được tối ưu hóa cẩn thận. Nó có thể đảm bảo rằng quá trình sửa đổi poly(A) và phiên mã ngược của đầu 3' miRNA được thực hiện đồng thời một cách hiệu quả.

Hình 5. 11171ES -Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

Một thế hệ thuốc thử phát hiện PCR định lượng huỳnh quang pha sẵn mới được phát triển đặc biệt để phát hiện định lượng miRNA, chứa Thuốc nhuộm tham chiếu thụ động ROX đặc biệt, phù hợp với tất cả các thiết bị qPCR, không cần điều chỉnh nồng độ ROX trên các thiết bị khác nhau, chỉ cần trong phản ứng chuẩn bị, có thể thực hiện khuếch đại bằng cách thêm mồi và khuôn mẫu vào hệ thống. DNA polymerase sử dụng polymerase khởi động nóng được biến đổi về mặt hóa học và hợp tác với hệ thống đệm đặc biệt, giúp độ đặc hiệu và độ nhạy của phản ứng cao hơn và có thể định lượng chính xác trong phạm vi rộng hơn.

2.2 Hiệu suất sản phẩm

2.2.1 Tương thích với tất cả các thiết bị qPCR nền tảng

Hình 6. Kết quả tương thích với các thiết bị qPCR khác nhau

Sử dụng tổng RNA của tế bào 293T làm khuôn mẫu, phiên mã ngược được thực hiện bằng Bộ tổng hợp cDNA sợi 1 miRNA Hifair™ (Cat# 11148ES).cDNA thu được được pha loãng 10 lần, sau đó sử dụng Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) để phát hiện các gen tham chiếu nội bộ của hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p và U6.

2.2.2 Tỷ lệ phát hiện cao, lên đến 10 pg

Hình 7. Biểu đồ khuếch đại

Hình 8. Biểu đồ khuếch đại

Sử dụng hsa-miR-let-7e-5p(a) tổng hợp và RNA tổng số tế bào 293T(b) làm khuôn mẫu, pha loãng thành các gradient sau đây tương ứng: 60 bản sao thành 606 bản sao (6 gradient) và 10 pg-100 ng (5 gradient), phiên mã ngược bằng Bộ tổng hợp cDNA sợi 1 Hifair™ miRNA (Cat# 11148ES) và cDNA thu được được phát hiện bằng Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) để biểu hiện gen hsa-miR-let-7e -5p.

2.2.3 Độ đặc hiệu cao, có khả năng phân biệt sự khác biệt về một base giữa các miRNA trong cùng một họ

Hình 9. Phân biệt sự khác biệt giữa các cơ sở đơn giữa các miRNA

Họ hsa-let-7 của con người có nhiều miRNA, với một số ít bazơ khác nhau, hoặc thậm chí chỉ khác nhau một bazơ. Các miRNA tổng hợp cho mỗi dạng đồng phân Let-7 (hsa-miR-let-7a~Let-7i, has-miR-98) được phiên mã ngược thành cDNA bằng Bộ tổng hợp cDNA sợi 1 Hifair™ miRNA (Cat# 11148ES), sử dụng Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) để khuếch đại các miRNA này riêng biệt với các đoạn mồi khác nhau và tính tỷ lệ khớp bằng Phương trình 2-ΔCT x 100%. Kết quả cho thấy có thể phân biệt hiệu quả các thành viên họ phân nhóm có quan hệ gần.

2.2.4 Hiệu suất khuếch đại tuyệt vời

Hình 10. Hiệu suất khuếch đại

Hình 11. Hiệu suất khuếch đại

Các gen miR-let-7b-5p, miR-let-7c-5p, miR-let-7e-5p, miR-let-7f-5p được khuếch đại bằng cách sử dụng tế bào 293T của người và RNA tổng số gan chuột làm khuôn mẫu. Kết quả cho thấy rằng so với các sản phẩm tương tự, Hifair™ miRNA 1st Strand cDNA Synthesis Kit (Cat# 11148ES) phù hợp với hệ thống phản ứng của Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES) với hiệu suất tuyệt vời.

2.2.5 Độ ổn định tuyệt vời

Hình 12. Phân tích độ ổn định của sản phẩm ở 37℃ trong 7 ngày

Hình 13. Phân tích kết quả sau 50 chu kỳ đông lạnh-tan băng

Hình 14. Tính chất phân tích ổn định của hệ thống phản ứng định lượng ở các nhiệt độ khác nhau trong 24 giờ

Phiên mã ngược được thực hiện bằng Bộ tổng hợp cDNA Hifair™ miRNA 1st Strand (Cat# 11148ES) sử dụng RNA tổng số tế bào 293T làm khuôn mẫu và cDNA thu được được pha loãng 10 lần và phát hiện bằng Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11171ES). Biểu hiện hsa-miR-let-7b-5p, hsa-miR-let-7c-5p, hsa-miR-let-7e-5p. △Ct<0,5.

2.3 Yeasen Kết hợp định lượng đảo ngược vòng-thân miRNA (11139ES&11170ES)

Hình 15. Bộ tổng hợp cDNA sợi 11139ES-Hifair™ III (máy tiêu hóa gDNA cộng thêm)

Bộ dụng cụ này được phát triển dựa trên Hifair™ III Reverse Transcriptase.Tốc độ tổng hợp cDNA của enzyme nhanh, độ ổn định nhiệt được cải thiện đáng kể. Đồng thời, enzyme tăng cường ái lực với khuôn mẫu và phù hợp với phiên mã ngược của một lượng nhỏ khuôn mẫu và gen có số lượng bản sao thấp. Khả năng tổng hợp cDNA toàn phần của Hifair™ III Reverse Transcriptase cũng được cải thiện, cho phép tổng hợp cDNA lên đến 19,8 kb.

Hình 16. 11170ES-Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix

Sản phẩm này là hỗn hợp chính đặc biệt để định lượng miRNA bằng phương pháp huỳnh quang chimeric SYBR Green I. Vì trình tự miRNA ngắn và trình tự miRNA trong cùng một họ thường rất giống nhau nên tính đặc hiệu là cực kỳ cần thiết trong quá trình định lượng. Sản phẩm này dựa trên DNA polymerase khởi động nóng, với đệm được tối ưu hóa, có thể làm giảm đáng kể sự khuếch đại không đặc hiệu; đồng thời, thuốc nhuộm tham chiếu ROX đặc biệt làm cho hỗn hợp chính phù hợp với tất cả các thiết bị qPCR và không cần phải điều chỉnh ROX trên các thiết bị khác nhau. Có thể thực hiện khuếch đại bằng cách thêm mồi và khuôn mẫu khi chuẩn bị hệ thống phản ứng.

2.3.1 Tương thích với tất cả các thiết bị qPCR nền tảng

Hình 17. Kết quả tương thích với các thiết bị qPCR khác nhau

Sử dụng tổng RNA của tế bào gan chuột làm khuôn mẫu, phiên mã ngược được thực hiện với Hifair™ III 1st Strand
Bộ tổng hợp cDNA (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES), pha loãng cDNA thu được gấp 40 lần và sử dụng Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) để khuếch đại gen mmu-miR-125a của người.

2.3.2 Độ nhạy cao, lên đến 10 pg

Hình 18. Phát hiện độ nhạy

Sử dụng tổng RNA của tế bào gan chuột làm khuôn mẫu, phiên mã ngược được thực hiện bằng Bộ tổng hợp cDNA sợi 1 Hifair™ III (máy tiêu hóa gDNA plus) (Cat# 11139ES) và cDNA thu được được pha loãng theo chuỗi 10 lần (phạm vi 10pg/μL). -0,1 μg/μL), khuếch đại các gen mmu-miR-125a, mmu-miR-132 và mmu-miR-351 có nguồn gốc từ chuột.

2.3.3 Độ đặc hiệu cao, có khả năng phân biệt sự khác biệt về một base giữa các miRNA trong cùng một họ

Hình 19. Phân biệt sự khác biệt giữa các cơ sở đơn giữa các miRNA

Họ hsa-let-7 của con người có nhiều miRNA, với một số ít bazơ khác nhau, hoặc thậm chí chỉ có một bazơ khác biệt. Các miRNA này được khuếch đại riêng biệt với các đoạn mồi khác nhau bằng cách sử dụng Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) và tỷ lệ khớp được tính bằng công thức 2^-Δct x 100%.

2.3.4 Độ lặp lại tốt

Hình 20. Phát hiện khả năng lặp lại

Sử dụng RNA tổng số của tế bào 293T của người làm khuôn mẫu cho phiên mã ngược, phiên mã ngược được thực hiện bằng Bộ tổng hợp cDNA sợi 1 Hifair™ III (máy tiêu hóa gDNA plus) (Cat# 11139ES), pha loãng cDNA thu được gấp 50 lần và sử dụng Hieff™ miRNA Universal qPCR SYBR Master Mix (Cat# 11170ES) để khuếch đại gen hsa-let-7a của người trong thí nghiệm sao chép 90 giếng.

2.3.5 Độ ổn định tốt

Hình 21.Phân tích độ ổn định của 11170ES ở các nhiệt độ khác nhau trong 14 ngày

Hình 22. Phân tích quá trình đông lạnh và rã đông lặp lại của 11170ES

Hình 23. Tính chất phân tích ổn định của hệ thống phản ứng định lượng ở các nhiệt độ khác nhau trong 24 giờ

Tổng RNA của tế bào gan chuột được sử dụng làm khuôn mẫu cho phiên mã ngược với Bộ tổng hợp cDNA Hifair™ III 1st Strand (gDNA digester plus) (Cat# 11139ES). CDNA thu được được pha loãng 100 lần để khuếch đại gen mmu-miR-132 ở chuột.

3. Danh sách sản phẩm liên quan

Yeasen Công ty TNHH Công nghệ sinh học (Thượng Hải), được thành lập vào năm 2014, là một doanh nghiệp công nghệ cao tham gia vào hoạt động R & D và sản xuất nguyên liệu enzyme công cụ và kháng thể kháng nguyên. Các sản phẩm của công ty bao gồm enzyme chẩn đoán phân tử, protein và kháng thể được sử dụng trong dược phẩm, thử nghiệm an toàn thực phẩm, chăn nuôi, tư pháp và các ngành công nghiệp khác. Chúng tôi cam kết cung cấp cho khách hàng trong lĩnh vực khoa học sự sống các sản phẩm và dịch vụ chất lượng cao. Các sản phẩm liên quan do Yeasen như sau:

Bảng 2. Danh sách sản phẩm liên quan