Bộ tổng hợp RNA năng suất cao T7 tối ưu hóa hệ thống phản ứng phiên mã. Bộ dụng cụ có thể tổng hợp RNA mạch đơn hiệu quả bằng cách sử dụng T7 RNA polymerase, DNA mạch đôi tuyến tính với trình tự khởi động T7 làm khuôn mẫu và NTP làm chất nền để kiểm soát trình tự DNA hạ lưu của promoter. Trong quá trình phiên mã, các nucleotide đã sửa đổi có thể được thêm vào chất nền để chuẩn bị biotin hoặc RNA được gắn nhãn thuốc nhuộm.

1. Giới thiệu Bộ tổng hợp RNA năng suất cao T7
2. Nguyên tắc của trong ống nghiệm phiên âm
3. Ưu điểm của Yeasen Bộ tổng hợp RNA năng suất cao T7
4. Hiệu suất sản phẩm
5. Cách sử dụng bộ dụng cụ này
6. Những câu hỏi thường gặp
7. Thông tin đặt hàng

1. Giới thiệu Bộ tổng hợp RNA năng suất cao T7

Bộ tổng hợp RNA năng suất cao T7 có thể tổng hợp cả bản sao dài và bản sao ngắn, và RNA có thể được sản xuất 100-200 μg với 1 μg đầu vào khuôn mẫu DNA. RNA tổng hợp có thể được sử dụng cho nhiều ứng dụng hạ nguồn khác nhau, chẳng hạn như nghiên cứu cấu trúc và chức năng của RNA, bảo vệ RNase, lai hóa đầu dò, can thiệp RNA, tiêm vi mô và trong ống nghiệm bản dịch.

2. Nguyên tắc của trong ống nghiệm phiên âm

Hình 1. Trong ống nghiệm quá trình phiên mã

3. Ưu điểm của Yeasen Bộ tổng hợp RNA năng suất cao T7

Năng suất cực cao—lên tới 200 µg trong 2 giờ
Đa năng—phù hợp với bản sao RNA 20nt-10000nt
Nhiều công dụng—tạo ra RNA không có nhãn, có nhãn hoặc có nắp

4. Hiệu suất sản phẩm

Hình 2. So sánh năng suất IVT

Lưu ý: Tất cả các thuốc thử phản ứng đều từ Bộ tổng hợp RNA T7 (Yeasen#10623 hoặc công ty B*). Phản ứng IVT tạo ra Yeasen và công ty B* được hiển thị ở trên.

Hình 3. Chất lượng sản phẩm phiên mã ở các độ dài khác nhau

Hình 4. Mức độ biểu hiện của mRNA được phiên mã trong tế bào HEK-293

Lưu ý: mRNA được gắn với Enzym gắn Vaccinia (Yeasen#10614/10615)

5. Cách sử dụng bộ dụng cụ này

5.1 Thuốc thử rã đông

Ly tâm hỗn hợp T7 RNA Polymerase trong thời gian ngắn và đặt trên đá. Rã đông đệm phiên mã 10× và ribonucleotide (ATP, CTP, GTP, UTP), trộn và ly tâm đến đáy ống, đặt đệm phiên mã 10× ở nhiệt độ phòng và đặt bốn loại ribonucleotide trên đá.

5.2 Chuẩn bị hệ thống phản ứng phiên mã theo bảng sau

Bảng 1.Phương pháp chuẩn bị hệ thống phản ứng phiên mã

Ghi chú:
a) Phản ứng được chuẩn bị ở nhiệt độ phòng. Vì đệm phiên mã 10× có chứa spermidine, nồng độ spermidine quá cao ở nhiệt độ thấp sẽ gây ra sự kết tủa khuôn DNA.
b) Bản sao ngắn (<100 nt), có thể sử dụng khuôn mẫu 2 µg, thời gian phiên mã tăng lên 4-8 giờ.
c) Đối với bản sao dài (>1000 nt), nên sử dụng khuôn mẫu plasmid tuyến tính để phiên mã.
d) Thực hiện phản ứng trong máy PCR khi nắp nóng mở để tránh dung dịch phản ứng bị bay hơi trong thời gian dài.
e) Sản phẩm phản ứng có thể có kết tủa màu trắng. Đây là magie pyrophosphat được tạo thành từ pyrophosphat tự do và các ion magie trong quá trình phản ứng, sẽ không ảnh hưởng đến các thí nghiệm tiếp theo. Bạn có thể thêm EDTA để loại bỏ nó. Nếu bạn lo ngại việc thêm EDTA sẽ ảnh hưởng đến các thí nghiệm tiếp theo, phần chất lỏng nổi cũng có thể được thu hồi bằng cách ly tâm.
f) Thuốc thử và vật chứa phải không bị nhiễm RNase.

5.3 Ủ ở 37°C trong 2 giờ

Trộn dung dịch phản ứng trên, ly tâm nhanh đến đáy ống và ủ ở 37°C trong 2 giờ. Nếu độ dài bản sao nhỏ hơn 100 nt, hãy tăng thời gian phản ứng lên 4-8 giờ.

5.4 Xử lý DNase I (tùy chọn)

Sau khi phản ứng hoàn tất, thêm 2 μL DNase I (không chứa RNase) vào mỗi ống và ủ ở 37°C trong 15 phút để loại bỏ DNA khuôn mẫu.

6. Những câu hỏi thường gặp

6.1 Hiệu suất phản ứng IVT thấp

Chất lượng mẫu có liên quan chặt chẽ đến năng suất. Nếu năng suất của nhóm thử nghiệm thấp hơn đáng kể so với nhóm đối chứng dương tính, thì có thể có những lý do sau.
① Các mẫu chứa các thành phần có tác dụng ức chế phản ứng IVT.
② Có vấn đề gì đó không ổn với mẫu.

6.2 Gợi ý

① Làm sạch lại mẫu.
② Xác nhận nồng độ và tính toàn vẹn của mẫu.
③ Kéo dài thời gian phản ứng.
④ Tăng đầu vào của mẫu.
⑤Thử các RNA polymerase khác và các chất xúc tiến tương ứng.

6.3 Năng suất của bản sao ngắn là thấp

Nếu bản sao mục tiêu ngắn hơn 100 nt, hãy kéo dài thời gian phản ứng lên 4-8 giờ hoặc tăng lượng mẫu đầu vào lên 2ug trong hệ thống phản ứng 20 μL.

6.4 Có những bản ghi chép dài hơn không mong đợi

Nếu kết quả điện di gel cho thấy có bản sao dài hơn dự kiến ​​thì có thể có những lý do sau:
① Mẫu plasmid có thể không được tuyến tính hóa hoàn toàn.
②Các mẫu có đầu dính chặt với phần nhô ra là 3'.
③Bản sao có cấu trúc thứ cấp không bị biến tính hoàn toàn.

6.5 Gợi ý

①Kiểm tra xem khuôn mẫu plasmid có được tuyến tính hóa hoàn toàn không. Nếu cần, hãy thực hiện tuyến tính hóa plasmid một lần nữa.
②Chọn enzyme hạn chế thích hợp để tuyến tính hóa khuôn mẫu plasmid và tránh tạo ra các đầu dính với phần nhô ra 3'. Có thể sử dụng đoạn Klenow hoặc DNA polymerase T4 để tạo ra đầu tù nếu cần thiết.
③Sử dụng gel biến tính để phát hiện bản sao.

6.6 Có những bản ghi chép ngắn hơn không mong đợi

Nếu kết quả điện di gel cho thấy có bản sao ngắn hơn mong đợi thì nguyên nhân có thể là:
①Có một trình tự tương tự như trình tự kết thúc của RNA polymerase T7 trong khuôn mẫu.
②Nội dung GC của các mẫu cao.

6.7 Gợi ý

①Giảm nhiệt độ phản ứng (chẳng hạn như 30℃) nhưng lưu ý rằng đôi khi việc giảm nhiệt độ phản ứng sẽ làm giảm sản lượng.
②Thử các RNA polymerase khác để xúc tác phản ứng IVT.
③Nếu hàm lượng GC của mẫu cao, hãy đặt nhiệt độ phản ứng IVT ở mức 42℃ hoặc thêm SSB vào hệ thống phản ứng IVT để tăng năng suất và độ dài của bản sao.

6.8 Có hiện tượng nhòe bản sao trong quá trình điện di gel

Nếu có hiện tượng nhòe bản sao trong quá trình điện di gel, những lý do có thể là:
①Có sự nhiễm bẩn RNase trong quá trình vận hành thử nghiệm.
② Khuôn mẫu DNA bị nhiễm RNase.

6.9 Gợi ý

①Đảm bảo tất cả các thuốc thử đều được pha chế bằng H2O không chứa RNase. Sử dụng đầu pipet không chứa RNase và ống Eppendorf và đeo găng tay và khẩu trang cao su dùng một lần trong quá trình vận hành thử nghiệm.
②Tái tinh chế mẫu DNA.

7. Thông tin đặt hàng

Sau đây là các sản phẩm tiêu biểu được cung cấp bởi Yeasen. Có sẵn các kích thước bổ sung. Sản phẩm của chúng tôi được tối ưu hóa cao để hoạt động đồng bộ, giúp đảm bảo hiệu suất và khả năng tái tạo vượt trội.
Chúng tôi cũng có thể cung cấp dịch vụ tùy chỉnh. Nếu bạn quan tâm đến sản phẩm không được hiển thị, hãy liên hệ với chúng tôi và chúng tôi sẽ làm việc với bạn để đáp ứng nhu cầu của bạn.

Bảng 2.Thông tin sản phẩm

Về việc đọc:

Thuốc thử đạt chuẩn GMP cho tổng hợp mRNA trong ống nghiệm

Yeasen Công nghệ sinh học GMP Cấp mRNA Tổng hợp trong ống nghiệm Nguyên liệu thô