Thành tựu đột phá từ Yeasen và công nghệ sinh học Molefuture

Với sự phát triển nhanh chóng của công nghệ sinh học, liệu pháp mRNA, như một phương pháp điều trị mới nổi, đã thu hút được nhiều sự chú ý do khả năng lập trình mạnh mẽ và tốc độ phản ứng nhanh. Trong các lĩnh vực như vắc-xin mRNA và liệu pháp gen, tổng hợp hiệu quả mRNA chất lượng cao là một bước quan trọng để đạt được mục tiêu điều trị. Trong quá trình này, T7 RNA polymerase đóng vai trò quan trọng vì nó có thể xúc tác hiệu quả quá trình tổng hợp mRNA trong ống nghiệm.

Vấn đề sản phẩm phụ dsRNA của T7 RNA polymerase

Mặc dù T7 RNA polymerase đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp mRNA, nhưng hoạt động thực tế thường dẫn đến việc sản xuất RNA sợi đôi (dsRNA) như một sản phẩm phụ. Sự hiện diện của dsRNA không chỉ làm giảm năng suất và độ tinh khiết của mRNA mà còn có thể kích hoạt phản ứng miễn dịch không đặc hiệu, ảnh hưởng đến hiệu quả và độ an toàn. Do đó, việc giảm sản xuất dsRNA đã trở thành nhu cầu cấp thiết trong ngành. Hiện nay, các phương pháp để giảm dsRNA chủ yếu bao gồm tối ưu hóa các điều kiện phản ứng và sử dụng các enzyme phụ trợ. Mặc dù các phương pháp này có thể làm giảm sản xuất dsRNA ở một mức độ nào đó, nhưng chúng thường đi kèm với các vấn đề như hoạt động phức tạp và chi phí tăng.

Tại sao chúng ta nên thực hiện kỹ thuật polymerase RNA T7?

Sửa đổi trực tiếp T7 RNA polymerase để giảm sản xuất dsRNA là một giải pháp cơ bản hơn. Các kỹ thuật tiến hóa do enzyme chỉ đạo có thể cải thiện các đặc tính xúc tác của nó và tăng độ tinh khiết và năng suất sản phẩm bằng cách thay đổi chính xác trình tự hoặc cấu trúc amino acid của enzyme. Đối với T7 RNA polymerase, sửa đổi có mục tiêu không chỉ có thể giảm sản xuất dsRNA mà còn tăng cường hiệu quả và chất lượng tổng hợp mRNA.

Là nhà cung cấp nguyên liệu tổng hợp mRNA trong ống nghiệm, Yeasen Công nghệ sinh học và công ty con Molefuture của nó Công nghệ sinh học, có đã phát triển một loại RNA polymerase T7 mới—sử dụng nền tảng tiến hóa có định hướng ZymeEditor. Để giảm thiểu việc sản xuất các sản phẩm phụ như dsRNA trong quá trình phiên mã trong ống nghiệm, nhóm tiến hóa đã thiết kế RNA polymerase T7 thông qua sự kết hợp giữa thiết kế hợp lý và sàng lọc có định hướng.

dsRNA được tạo ra như thế nào?

Theo các báo cáo tài liệu, quá trình sản xuất sản phẩm phụ dsRNA chủ yếu bắt nguồn từ hai nguồn (Hình 1): Nguồn đầu tiên là trong quá trình chuyển đổi của T7 RNA polymerase từ cấu hình khởi đầu sang cấu hình kéo dài trong giai đoạn đầu của phiên mã, phức hợp ba thành phần phiên mã dễ bị phân ly [1], dẫn đến việc giải phóng một số lượng lớn các chuỗi RNA ngắn (RNA phá vỡ) có chiều dài khoảng 20 nt vào hệ thống. Các chuỗi RNA này hoạt động như "mồi", ghép đôi bổ sung với các chuỗi RNA dài và mở rộng để tạo ra dsRNA dưới tác động của hoạt động RNA polymerase phụ thuộc RNA của T7 RNA polymerase (hoạt động RDRP) [2,3]. Nguồn thứ hai được kích hoạt bởi hoạt động chuyển ribonucleotide đầu cuối do T7 RNA polymerase sở hữu. Khi phản ứng phiên mã đạt đến cuối khuôn mẫu tuyến tính, T7 RNA polymerase có thể ngẫu nhiên thêm một số ribonucleotide mà không phụ thuộc vào khuôn mẫu. Các ribonucleotide này, tạo thành "mồi ngẫu nhiên", có thể đảo ngược và ghép đôi bổ sung với vùng mRNA mục tiêu, mở rộng để tạo ra dsRNA. dsRNA được tạo ra thông qua vòng lặp được gọi là dsRNA vòng lặp [3,4]. Do đó, để giảm các sản phẩm phụ của dsRNA, trọng tâm của sửa đổi RNA polymerase T7 nằm ở việc ổn định phức hợp ba thành phần phiên mã sớm hoặc làm suy yếu hoạt động chuyển giao đầu cuối và RNA polymerase phụ thuộc (RDRP) hoạt động của T7 RNA polymerase.

Hình 1. Sơ đồ nguyên lý của hàng rào năng lượng và hình thành dsRNA (dữ liệu chưa công bố)

Làm thế nào để vượt qua rào cản năng lượng của RNA polymerase T7 chuyển đổi cấu hình?

Thông qua phân tích cấu trúc và năng lượng tự do, một mặt, nhóm nghiên cứu phát hiện ra rằng cùng với những thay đổi về cấu hình của T7 RNA polymerase, cũng có sự thay đổi về năng lượng. Năng lượng tự do của cấu hình kéo dài cao hơn đáng kể so với cấu hình khởi đầu, cho thấy quá trình phiên mã cần vượt qua rào cản năng lượng cao hơn để tạo ra chuỗi mRNA hoàn chỉnh. Rào cản năng lượng cao không thuận lợi cho quá trình chuyển đổi cấu hình trơn tru. Do đó, nhóm nghiên cứu đã sử dụng hợp lý phương pháp sàng lọc để xác định hơn 20 axit amin điểm nóng và xây dựng các thư viện đột biến bão hòa tương ứng.

Làm thế nào để sửa đổi hoạt động chuyển giao đầu cuối và RDRP của T7 RNA polymerase

Mặt khác, xét đến các báo cáo hạn chế về chức năng, vị trí và miền cấu trúc liên quan đến hoạt động chuyển giao đầu cuối và RDRP của T7 RNA polymerase, và vì hai hoạt động này, có chức năng tương tự nhau, có khả năng chia sẻ các vị trí chính với phản ứng chính của T7 RNA polymerase—hoạt động phiên mã (tức là hoạt động trùng hợp RNA phụ thuộc DNA, DDRP)—nên rất khó để tìm thấy các axit amin điểm nóng để sửa đổi theo vị trí. Do đó, nhóm nghiên cứu đã đồng thời xây dựng một số thư viện đột biến ngẫu nhiên dựa trên PCR dễ xảy ra lỗi, kết hợp với khả năng tiến hóa thông lượng cao của nền tảng ZymeEditor, dẫn đến sự đa dạng vượt quá 10^6 cho mỗi thư viện riêng lẻ.

Khám phá dựa trên thăm dò lý tưởng RNA polymerase T7

Để cân bằng quá trình sản xuất RNA polymerase T7 và theo dõi hàm lượng dsRNA trong phản ứng phiên mã trong ống nghiệm, nhóm nghiên cứu đã tham khảo các khuôn mẫu phiên mã được tối ưu hóa, thiết kế cẩn thận nhiều huỳnh quang các đầu dò nhắm vào các vùng khác nhau của sản phẩm mRNA mục tiêu. Các đầu dò này liên kết thông tin như năng suất phản ứng, tính toàn vẹn và hàm lượng dsRNA trong hệ thống với các tín hiệu huỳnh quang. Cường độ huỳnh quang của hệ thống càng mạnh thì hiệu suất của đột biến càng có lợi. Về mặt lý thuyết, phương pháp sàng lọc này có thể xếp hạng các đột biến dựa trên cường độ huỳnh quang của các đầu dò khác nhau, thu được các đột biến T7 RNA polymerase có năng suất cao hoặc giảm RNA Abortive, cũng như các đột biến có tính toàn vẹn được cải thiện hoặc giảm dsRNA vòng lặp. Khi khuôn mẫu phản ứng được thay thế bằng RNA, các đột biến có hoạt động RDRP giảm cũng có thể được sàng lọc tiêu cực, cải thiện tính chọn lọc khuôn mẫu của T7 RNA polymerase. Ngoài ra, bằng cách thêm các nucleotide đã sửa đổi, các chất tương tự mũ và tăng nhiệt độ phản ứng trong hệ thống phản ứng giọt, có thể tiến hành sàng lọc thêm để chọn các đột biến T7 RNA polymerase có khả năng chịu được các chất nền không tự nhiên và thể hiện tính ổn định nhiệt được cải thiện.

Cách sàng lọc tốt nhất RNA polymerase T7?

Dựa trên quy mô của các thư viện, nhóm đã phát triển các quy trình sàng lọc thông lượng cực cao dựa trên phương pháp phân loại giọt được kích hoạt bằng huỳnh quang (FADS) và các quy trình sàng lọc thông lượng cao dựa trên phương pháp vi mảng truyền thống (MTPS).Qua nhiều vòng thí nghiệm, tổng cộng hơn 10^7 đột biến đã được sàng lọc, tạo ra nhiều đột biến có hàm lượng dsRNA giảm đáng kể. Trong số đó, một số đột biến cho thấy hàm lượng dsRNA giảm do RNA Abortive gây ra trong phản ứng, cho thấy cấu hình kéo dài của các đột biến polymerase này ổn định hơn. Một số đột biến cho thấy hàm lượng dsRNA vòng lặp giảm trong phản ứng, cho thấy hoạt động chuyển đầu cuối hoặc hoạt động RDRP ở các đột biến này bị suy yếu.

Do lợi thế về hiệu suất của các đột biến nói trên xuất phát từ các cơ chế khác nhau nên nhóm nghiên cứu đã xây dựng các thư viện xáo trộn DNA nhắm vào họ. Sau khi sàng lọc, nhóm cuối cùng đã có được những đột biến có hiệu suất vượt trội với thế hệ dsRNA cực thấp trong khi không ảnh hưởng đến năng suất và tính toàn vẹn của mRNA (Hình 2). Tuy nhiên, năng suất của đột biến G47A+884G do Moderna phát hiện đã bị ảnh hưởng^[5] (chưa xuất bản).

Hình 2. Quá trình tiến hóa của enzyme và đặc điểm hiệu suất đột biến

(chưa xuất bản)

Phân tích thế hệ dsRNA bằng RNA polymerase T7 biến thể?

Sau khi phân tích định lượng, như thể hiện trong Hình 3, sử dụng khuôn mẫu phiên mã 9 kb trong điều kiện giới hạn phiên mã đồng thời, RNA polymerase T7 loại hoang dã tạo ra khoảng 2,9 ng/μg dsRNA khi sử dụng các nucleotide tự nhiên, trong khi một loại thương mại Enzym T7 sản xuất khoảng 0,18 ng/μg dsRNA. Tuy nhiên, sản xuất dsRNA của mỗi biến thể T7 RNA polymerase được xây dựng ít hơn 0,10 ng/μg. Đặc biệt, một khác nhau chỉ 0,015 ng/μg, thấp hơn gần 200 lần so với loại hoang dã và thấp hơn 12 lần so với loại thương mại sản phẩm. Sau nhiều lần thử nghiệm, lợi thế về hiệu suất của các biến thể trong việc giảm dsRNA đã được quan sát thấy một cách nhất quán trong các điều kiện phản ứng khác nhau, cho thấy khả năng tương thích hệ thống tốt của các đột biến này và đặt nền tảng cho việc giảm thêm sản xuất dsRNA thông qua đệm phản ứng tối ưu hóa. Ngoài ra, sàng lọc FADS cũng thu được nhiều biến thể có tính toàn vẹn sản phẩm và độ ổn định nhiệt được cải thiện, có thể đáp ứng các yêu cầu của nhiều ứng dụng phiên mã trong ống nghiệm hơn

Hình 3. Đánh giá quá trình tạo ra dsRNA bằng các biến thể polymerase RNA T7 được đánh giá bằng cách sử dụng Yeasen Bộ xét nghiệm ELISA RNA sợi đôi (dsRNA) và phân tích chấm kháng thể J2.

Hiện tại, một số đối tác đã thử nghiệm các biến thể RNA polymerase T7 và chúng tôi đã nhận được nhiều lời khen ngợi từ họ. Việc sử dụng enzyme mới giúp đơn giản hóa quá trình tinh chế mRNA, nâng cao hiệu quả công việc và chứng minh hiệu suất vượt trội trong nhiều tình huống ứng dụng.

Những biến thể này đang được cấp bằng sáng chế và chúng tôi hoan nghênh các cuộc thảo luận về hợp tác công nghệ và cấp phép.

Giới thiệu về Molefuture Biotechnology

Molefuture Biotechnology là công ty con của Yeasen Công ty TNHH Công nghệ sinh học (Thượng Hải), chuyên cung cấp các giải pháp biến đổi enzyme tùy chỉnh được thúc đẩy bởi công nghệ tiến hóa enzyme.Tận dụng các nguồn lực của Yeasen Công nghệ sinh học, Molefuture hoạt động trên sáu nền tảng công nghệ chính: nền tảng tiến hóa enzyme cải tiến ZymeEditor, nền tảng biểu hiện hiệu suất cao đa vật chủ, nền tảng phát triển quy trình lên men, nền tảng phát triển quy trình tinh chế, nền tảng sản xuất enzyme siêu sạch và nền tảng phân tích enzyme và kiểm soát chất lượng. Với sáu nền tảng công nghệ này, Molefuture có thể cung cấp một bộ giải pháp tùy chỉnh hoàn chỉnh bao gồm tiến hóa theo hướng enzyme, phát triển enzyme mới, phát triển quy trình enzyme và sản xuất mở rộng quy mô cấp GMP để đáp ứng nhu cầu ứng dụng enzyme trong các lĩnh vực như chẩn đoán in vitro, y sinh học, sinh học tổng hợp, thẩm mỹ y khoa, sản phẩm trung gian dược phẩm, v.v.

Thông tin đặt hàng

Sau đây là các sản phẩm tiêu biểu được cung cấp bởi Yeasen. Có sẵn các kích thước bổ sung. Sản phẩm của chúng tôi được tối ưu hóa cao để hoạt động đồng bộ, giúp đảm bảo hiệu suất và khả năng tái tạo vượt trội. Chúng tôi cũng có thể cung cấp các dịch vụ tùy chỉnh. Nếu bạn quan tâm đến một sản phẩm không được hiển thị, hãy liên hệ với chúng tôi và chúng tôi sẽ làm việc với bạn để đáp ứng nhu cầu của bạn.

Về việc đọc:

Chia sẻ Báo cáo xác nhận Bộ xét nghiệm ELISA RNA sợi đôi (dsRNA) để thúc đẩy chuẩn hóa phát hiện dsRNA.

Tài liệu tham khảo:

[1] Sousa R, Mukherjee S. T7 RNA polymerase[J]. Tiến bộ trong nghiên cứu axit nucleic và sinh học phân tử, 2003: 1-41.

[2] Steitz T A. Những thay đổi về cấu trúc của T7 RNA polymerase từ khởi đầu phiên mã đến kéo dài[J]. Ý kiến ​​hiện tại về sinh học cấu trúc, 2009, 19(6): 683-690.

[3] Vallejo D, Nikoomanzar A, Paegel BM, et al. Phân loại giọt được kích hoạt bằng huỳnh quang cho quá trình tiến hóa hướng đến tế bào đơn lẻ[J]. Sinh học tổng hợp ACS, 2019, 8(6): 1430-1440.

[4] Gholamalipour Y, Karunanayake Mudiyanselage A, Martin C T. Các phần bổ sung đầu 3′ của T7 RNA polymerase là RNA tự tạo mẫu, phân phối và có đặc điểm đa dạng—phân tích RNA-Seq[J]. Nghiên cứu axit nucleic, 2018, 46(18): 9253-9263.

[5] Dousis A, Ravichandran K, Hobert EM, et al. Một loại RNA polymerase T7 được thiết kế để sản xuất mRNA không có các sản phẩm phụ kích thích miễn dịch[J]. Nature Biotechnology, 2023, 41(4): 560-568.