Chia sẻ báo cáo xác thực của bộ ELISA RNA chuỗi đôi (DSRNA) để thúc đẩy tiêu chuẩn hóa phát hiện DSRNA.

Bạn đang tìm kiếm một cách đáng tin cậy để phát hiện dsRNA còn sót lại trong quá trình phiên mã mRNA trong ống nghiệm? Không cần tìm đâu xa hơn Bộ xét nghiệm ELISA RNA sợi đôi (dsRNA). Tuy nhiên, với một số bộ xét nghiệm thương mại có sẵn, điều quan trọng cần lưu ý là dữ liệu xác thực không phải lúc nào cũng có sẵn công khai, dẫn đến sự không nhất quán trong quá trình phát hiện dsRNA. Đó là lý do tại sao chúng tôi chia sẻ báo cáo xác thực của Bộ xét nghiệm ELISA RNA sợi đôi (dsRNA), bao gồm tính đặc hiệu, độ chính xác, độ chính xác, độ nhạy và độ bền. Báo cáo này đóng vai trò là hướng dẫn tham khảo để xác thực các phương pháp phát hiện dsRNA còn sót lại được điều chỉnh theo các điều kiện thử nghiệm cụ thể và các tiêu chuẩn dược điển quy định. Vui lòng tìm hiểu thêm về báo cáo xác thực của chúng tôi để thúc đẩy việc chuẩn hóa phát hiện dsRNA.

RNA sợi đôi (dsRNA) ELISA KNó

Lý lịch:

Bộ xét nghiệm ELISA RNA sợi đôi (dsRNA) là bộ xét nghiệm thuốc thử được thiết kế để phát hiện dsRNA còn sót lại được tạo ra trong quá trình phiên mã mRNA trong ống nghiệm. Sử dụng nguyên lý thử nghiệm của xét nghiệm miễn dịch hấp thụ liên kết enzyme sandwich kháng thể kép (ELISA) và hệ thống khuếch đại biotin-streptavidin, bộ xét nghiệm này cung cấp khả năng phát hiện nhạy cảm dsRNA còn sót lại trong mẫu.

Dữ liệu tóm tắt chứa các tham số xác thực bao gồm độ đặc hiệu, độ chính xác, độ chính xác, độ nhạy và độ bền. Báo cáo đóng vai trò là hướng dẫn tham khảo, thúc giục người dùng xác thực các phương pháp phát hiện dsRNA còn lại phù hợp với các điều kiện thử nghiệm cụ thể của họ và tuân thủ các tiêu chuẩn dược điển quy định.

Vật liệu và phương pháp:

Bộ dụng cụ: Bộ xét nghiệm ELISA RNA sợi đôi (dsRNA): Cat#36717ES (Yeasen)Bộ dụng cụ bao gồm bốn loại mẫu chuẩn dsRNA riêng biệt. Người dùng có thể chọn loại mẫu chuẩn phù hợp với quy trình cụ thể của họ để tạo đường cong chuẩn, do đó tránh được sự cần thiết phải chuẩn bị và thử nghiệm tất cả các mẫu.

Phương pháp: Các vật liệu và các bước thủ tục cần thiết cho thí nghiệm chủ yếu được chỉ định bởi Yeasen Công nghệ sinh học. Bộ dụng cụ đã trải qua quá trình thử nghiệm và đánh giá rộng rãi, đảm bảo hiệu suất của nó đáp ứng các yêu cầu quy định của ICH Q2(R1) và ấn bản năm 2020 của Dược điển Trung Quốc Phần bốn "Hướng dẫn xác nhận phương pháp phân tích 9101".

Kết quả

  1. Tính tuyến tính của các tiêu chuẩn dsRNA

Báo cáo này đã phát triển các đường cong chuẩn cho tất cả bốn loại chuẩn dsRNA riêng biệt, mỗi loại có chiều dài 300bp. Các chuẩn này bao gồm STD1, dsRNA chưa sửa đổi; STD2, dsRNA đã sửa đổi Pseudo-UTP; STD3, dsRNA đã sửa đổi N1-Me-Pseudo-UTP; và STD4, dsRNA đã sửa đổi 5-OMe-UTP. Mỗi loại chuẩn dsRNA đều thể hiện tính tuyến tính pha loãng tuyệt vời với R2 > 0,99 và hệ số biến thiên (CV) của nồng độ đo được nhỏ hơn 10% được thể hiện trong Bảng 1 đến Bảng 5.

Tên STD

Loại UTP

Độ tuyến tính của pha loãng (R2＞0,99)

Sơ yếu lý lịch

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 1

UTP

0.0156-1 pg/μL

＜10%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 2

pUTP

0,0156-1 pg/μL

＜10%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 3

N1-Me-pUTP

0,0312-1 pg/μL

＜10%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 4

5-OMe-UTP

0,0625-1 pg/μL

＜10%

Bảng 1. Tính tuyến tính của các tiêu chuẩn dsRNA khác nhau.

STD1 nồng độN. (pg/μL)

Đo lường trung bình (pg/μL)

Sự hồi phục

Sơ yếu lý lịch

1

1.0001

100,0%

3,1%

0,5

0,4994

99,9%

2,4%

0,25

0,2516

100,7%

3,3%

0,125

0,1227

98,1%

0,5%

0,0625

0,0640

102,5%

3,2%

0,0312

0,0309

99,2%

1,3%

0,0156

0,0157

100,4%

3,2%

0

/

/

/

Bảng 2.Sự phục hồi và CV của STD1 pha loãng

STD2 nồng độN. (pg/μL)

Đo lường trung bình (pg/μL)

Sự hồi phục

Sơ yếu lý lịch

1

1.0001

100,0%

0,7%

0,5

0,4994

99,9%

0,1%

0,25

0,2514

100,6%

0,9%

0,125

0,1232

98,6%

2,5%

0,0625

0,0635

101,6%

1,1%

0,0312

0,0312

99,9%

0,5%

0,0156

0,0155

99,6%

0,0%

0

/

/

/

Bảng 3. Sự phục hồi và CV của STD2 pha loãng

Kết nối STD3 (pg/μL)

Đo lường trung bình (pg/μL)

Sự hồi phục

Sơ yếu lý lịch

2

2.0031

100,2%

1.6%

1

0,9880

98,8%

2,4%

0,5

0,5188

103,8%

1,2%

0,25

0,2383

95,3%

2,2%

0,125

0,1242

99,4%

0,1%

0,0625

0,0629

100,7%

1,8%

0,0312

0,0361

115,7%

1,6%

0

/

/

/

Bảng 4. Sự phục hồi và CV của STD3 pha loãng

Kết nối STD4 (pg/μL)

Đo lường trung bình (pg/μL)

Sự hồi phục

Sơ yếu lý lịch

4

4.0096

100,2%

1,9%

2

1,9940

99,7%

0,7%

1

0,9977

99,8%

0,1%

0,5

0,5108

102.2%

0,1%

0,25

0,2454

98,2%

5,6%

0,125

0,1207

96,5%

2,8%

0,0625

0,0624

99,9%

0,3%

0

/

/

/

Bảng 5. Sự phục hồi và CV của STD4 pha loãng

  1. Tính đặc hiệu

  • Phân tích tính đặc hiệu với dsRNA, ssRNA, dsDNA và ssDNA.
Hình 1. Bộ dụng cụ này chỉ xác định dsRNA và không phát hiện ssRNA, dsDNA hoặc ssDNA.

  • Tính đặc hiệu không bị ảnh hưởng bởi độ dài của dsRNA.
Hình 2. Tính đặc hiệu của bộ dụng cụ vẫn nhất quán trên các dsRNA có độ dài khác nhau (160 bp và 500 bp).

  1. MỘTđộ chính xác

Thêm 0,5 pg/μL STD1 đối với mẫu mRNA đã biết có hàm lượng dsRNA là 0,36 pg/μL được tiến hành theo ba tỷ lệ thể tích khác nhau (1:1, 1:20, 1:250). Trong mọi trường hợp, tỷ lệ phục hồi đột biến đều nằm trong phạm vi 80-120%.

Tỷ lệ phục hồi đột biến được tính như sau: Đột biến Sự hồi phục Tỷ lệ = (Đo lường sự tập trung sau đó tăng đột biến×Tổng cộng âm lượng của có gai nhọn mẫu-Đã đo sự tập trung của cái mẫu×Tổng cộng âm lượng của cái mẫu)/(Lý thuyết sự tập trung của cái spike×Âm lượng của cái tăng đột biến)×100%

Mẫu

Tỷ lệ thể tích của STD1/Mẫu

dsRNA đo được (pg/μL)

Mũi nhọn Sự hồi phục Tỷ lệ

Mẫu (TS)

/

0,36

/

TS+0,5pg/μL Bệnh lây truyền qua đường tình dục 1

1:1

0,769

81%

TS+0,5pg/μL Bệnh lây truyền qua đường tình dục 1

1:20

0,777

82%

TS+0,5pg/μL Bệnh lây truyền qua đường tình dục 1

1:250

0.803

82%

Bảng 6. Tỷ lệ phục hồi đột biến Phân tích

  1. Độ chính xác

  • Độ chính xác trong xét nghiệm

Các thí nghiệm được tiến hành trên ba mức nồng độ (cao, trung bình và thấp) cho mỗi mẫu chuẩn dsRNA. Trong một thí nghiệm duy nhất, mỗi mẫu nồng độ trải qua tám lần thử nghiệm lặp lại. Kết quả cho thấy hệ số biến thiên (CV) dưới 15% cho thấy độ chính xác trong quá trình phân tích tốt.

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 1

Lý thuyết kết luận (pg/μL)

Bản sao

Đo trung bình (pg/μL)

Sơ yếu lý lịch

1

8

1.0002

3,11%

0,125

8

0,1230

0,46%

0,0156

8

0,0164

3,18%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 2

Lý thuyết kết luận (pg/μL)

Bản sao

Đo trung bình (pg/μL)

Sơ yếu lý lịch

1

8

1.0001

0,65%

0,125

8

0,1231

2,46%

0,0156

8

0,0162

0,02%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 3

Lý thuyết kết luận (pg/μL)

Bản sao

Đo trung bình (pg/μL)

Sơ yếu lý lịch

2

8

2.0022

1,58%

0,25

8

0,2444

2,17%

0,0312

8

0,0328

1,64%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 4

Lý thuyết kết luận (pg/μL)

Bản sao

Đo trung bình (pg/μL)

Sơ yếu lý lịch

8

8

8.0803

0,27%

1

8

0,9650

0,12%

0,125

8

0,1322

2.76%

Bảng 7. Phân tích độ chính xác trong xét nghiệm

  • Độ chính xác giữa các phép thử

Ba thí nghiệm đã được thực hiện bằng cách sử dụng bộ dụng cụ từ 3 các đợt. Trong mỗi thí nghiệm, nồng độ cao, trung bình và thấp được chọn và thử nghiệm ba lần cho mỗi mẫu chuẩn dsRNA trong bốn mẫu, với tám lần lặp lại. Do đó, 24 điểm dữ liệu đã được thu thập tại mỗi mức nồng độ, sau đó được sử dụng để phân tích hệ số biến thiên (CV). Kết quả cho thấy CV cho mỗi nồng độ của các tiêu chuẩn đều dưới 15%.

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 1

Lý thuyết kết luận (pg/μL)

Kiểm tra/Lặp lại độc lập

Đo trung bình (pg/μL)

Sơ yếu lý lịch

1

3/8

1.0007

2,38%

0,125

3/8

0,1186

3,20%

0,0156

3/8

0,0173

1,27%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 2

Lý thuyết kết luận (pg/μL)

Kiểm tra/Lặp lại độc lập

Đo trung bình (pg/μL)

Sơ yếu lý lịch

1

3/8

0,9987

0,09%

0,125

3/8

0,1269

1,06%

0,0156

3/8

0,0151

0,52%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 3

Lý thuyết kết luận (pg/μL)

Kiểm tra/Lặp lại độc lập

Đo trung bình (pg/μL)

Sơ yếu lý lịch

2

3/8

2.0012

2,37%

0,25

3/8

0,2415

0,14%

0,0312

3/8

0,0330

1,81%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 4

Lý thuyết kết luận (pg/μL)

Kiểm tra/Lặp lại độc lập

Đo trung bình (pg/μL)

Sơ yếu lý lịch

8

3/8

7.9735

1,89%

1

3/8

1.0225

0,13%

0,125

3/8

0.1227

5,63%

Bảng 8. Phân tích độ chính xác giữa các phép thử

  1. Độ nhạy

  • TỔNG QUAN

Giới hạn phát hiện của bộ dụng cụ được xác định bằng cách cộng gấp đôi độ lệch chuẩn vào giá trị trung bình của các giá trị trống. Bằng cách đo OD của 24 mẫu trống, tính giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của chúng, sau đó áp dụng các giá trị này vào đường cong được lắp, giới hạn phát hiện tương ứng được thu được.

ĐẠI HỌC

dsRNA Tiêu chuẩn

Trung bình của Trống

Thẻ: SD của Trống

Trung bình của Blank+2SD

TỔNG QUAN

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 1

0,016

0,00048

0,01696

≤0,001pg/μL

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 2

0,016

0,00072

0,01744

≤0,001pg/μL

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 3

0,034

0,00119

0,03638

≤0,001pg/μL

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 4

0,115

0,00290

0,1208

≤0,01pg/μL

Bảng 9. Phân tích LOD

  • TRỌNG LƯỢNG

Giới hạn định lượng của bộ dụng cụ được thiết lập bằng cách pha loãng điểm nồng độ thấp nhất của đường chuẩn xuống mức thậm chí còn thấp hơn, đảm bảo CV < 20% ở nồng độ thấp nhất, do đó xác định ngưỡng định lượng. LOQ như sau.

dsRNA Tiêu chuẩn

TRỌNG LƯỢNG

Bản sao

CV(%)

Sự hồi phục (%)

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 1

0,0156 pg/μL

24

＜10%

80~120%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 2

0,0312 pg/μL

24

＜10%

80~120%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 3

0,0156 pg/μL

24

＜10%

80~120%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 4

0,125 pg/μL

24

＜10%

80~120%
Bảng 10.Phân tích LOQ

  1. Dkhả năng uống được

  • Chống nhiễu trên vật liệu IVT

Bài kiểm tra này nhằm mục đích đánh giá tác động của nhiều loại enzyme, chất đệm, v.v. được thêm vào mARN mẫu trên bộ dụng cụ phát hiện dsRNA.

Thêm nồng độ cụ thể của T7 RNA polymerase, chất ức chế RNAse, IPPA (pyrophosphatase vô cơ), DNase I, VCE (enzym đóng nắp vaccinia), 2'-O-Methyltransferase (MT), đệm IVT 1× và natri citrat 1mM vào mẫu mRNA đã cung cấp và sau đó sử dụng STD3 cho cả việc chuẩn bị đường cong chuẩn và thử nghiệm mẫu, cho phép đánh giá khả năng của bộ dụng cụ trong việc phát hiện hàm lượng dsRNA trong các mẫu. Kết quả chứng minh rằng sự hiện diện của tám loại enzyme và đệm khác nhau không ảnh hưởng đến việc phát hiện chính xác dsRNA. Ngoài ra, tỷ lệ phục hồi quan sát được nằm trong khoảng từ 80% đến 120%.

Vật liệu IVT

dsRNA Đã đo (pg/μL)

Sự hồi phục

Không có

0,6057

100%

T7 RNA Polymerase (15μg/mL)

0,5411

89,32%

Chất ức chế RNase ở chuột (27,5μg/mL)

0,5142

84,88%

Pyrophosphatase vô cơ (IPPA 10μg/mL)

0,7132

117,7%

DNase I (13,75μg/mL)

0,6077

100,32%

Enzym đóng nắp cây đậu biếc (10μg/mL)

0,6563

108,3%

2´-O-Methyltransferase (10μg/mL)

0,5776

95,4%

1×Bộ đệm IVT

0,5003

82,6%

1mM Natri citrat

0,6251

103,2%

Bảng 11. Sự phục hồi của STD3 pha loãng được thêm vào vật liệu IVT

  • Nhiệt độ dkhả năng uống được

Các bộ dụng cụ được lưu trữ ở cả hai 4°C và 37°C để phát hiện sự thay đổi nồng độ của chuẩn dsRNA sau 7 ngày. Kết quả cho thấy các sự thay đổi đều nằm trong phạm vi 20%.

dsRNA Tiêu chuẩn

dsRNA Đo (pg/μL) Ngày 0

Các phương sai sau 7 ngày ở 4°C

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 1

1

10%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 2

1

5%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 3

2

7%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 4

4

11%

dsRNA Tiêu chuẩn

dsRNA Đã đo (pg/μL)

Các phương sai sau 7 ngày ở 37°C

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 1

1

18%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 2

1

4%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 3

2

5%

Bệnh lây truyền qua đường tình dục 4

4

8%

Bảng 12. Phân tích độ bền nhiệt độ


      Sản phẩm liên quan:

      Tên sản phẩm Mã sản phẩm Thông số kỹ thuật
      Bộ xét nghiệm ELISA RNA sợi đôi (dsRNA) 36717ES 48T/96T
      CleaScrip™ T7 RNA Polymerase (RNA ds thấp, 250 U/μL) 10628ES 10/100 KU
      RNA polymerase T7 Đạt chuẩn GMP (250 U/μL) 10625ES 10/100 KU

      Đọc thêm liên quan:

      Bộ xét nghiệm ELISA RNA sợi đôi (dsRNA) được sử dụng để xác nhận các đột biến RNA polymerase T7 có hàm lượng dsRNA thấp, kết hợp với phương pháp chấm kháng thể J2.

      Đột biến RNA Polymerase T7 dsRNA thấp, trao quyền cho sự phát triển vắc-xin và liệu pháp mRNA


      Tài liệu tham khảo:

      1. ICH, 2022: Xác nhận phương pháp phân tích Quý 2, bản dự thảo.
      2. NMPA, 2007: Nguyên tắc chung để đánh giá xác nhận phương pháp phân tích cho phân tích kiểm soát chất lượng sản phẩm sinh học
      3. Ủy ban Dược điển Trung Quốc (ChPC), 2020: Dược điển Trung Quốc, Phần bốn: Hướng dẫn xác nhận các phương pháp phân tích định lượng cho các mẫu sinh học

      Cuộc điều tra