Trong những năm gần đây, thuốc dựa trên mRNA đã thu hút được sự chú ý đáng kể và tập trung nghiên cứu. T7 RNAP được biết đến với tính đơn giản và khả năng xúc tác tổng hợp RNA với năng suất cao và độ trung thực trong ống nghiệm. Tuy nhiên, trong quá trình phiên mã, T7 RNAP có thể tạo ra các sản phẩm phụ như RNA ngắn bị phá vỡ, RNA kết thúc sớm và RNA mở rộng 3', tạo điều kiện thuận lợi cho sự hình thành dsRNA. Do đó, việc giảm sản xuất dsRNA đã trở thành nhu cầu cấp thiết trong các ứng dụng thực tế.
Gần đây, một nghiên cứu mang tính đột phá có tên là "FADS và thiết kế bán hợp lý đã sửa đổi RNA polymerase T7 làm giảm sản xuất dsRNA, với hoạt động transferase đầu cuối và RDRP thấp hơn" đã được xuất bản trực tuyến bởi
Sàng lọc T7 RNAP dựa trên FADS
Để sàng lọc T7 RNAP, FADS (phân loại giọt huỳnh quang) được chọn để đáp ứng các yêu cầu thông lượng cao của quá trình tiến hóa protein. Để ngăn ngừa sự phân mảnh sớm của tế bào, các nhà nghiên cứu đã sử dụng chip PDMS với hai pha nước, trong đó lysozyme được trộn với các tế bào trên chip và phát huy hoạt động của nó trong các giọt Hình 1. Các nhà nghiên cứu đã tạo ra một số thư viện đột biến ngẫu nhiên với sự đa dạng từ 105 đến106Sau khi sàng lọc, 10 biến thể trội đã được xác định và được chỉ định là Mut1 đến Mut10. Như thể hiện trong Hình 2E Và Hình 2F, hàm lượng dsRNA của Mut1, Mut7 và Mut9 thấp hơn đáng kể so với kiểu hoang dã
Hình 1. Tổng quan về FADS
Hình 2. Kiểm tra thư viện ngẫu nhiên và đánh giá các biến thể
Thiết kế bán hợp lý của T7 RNAP
Các nhà nghiên cứu đã tiến hành một cuộc thăm dò thiết kế bán hợp lý, tạo ra mười thư viện bão hòa tại một vị trí và sử dụng phương pháp thăm dò kép dựa trên tấm vi mô truyền thống để sàng lọc (Hình 3). Đầu dò đầu 5' được thêm vào được sử dụng để phát hiện sản lượng RNA.
Hình 3. Thiết kế bán hợp lý được hướng dẫn theo cấu trúc cho dsRNA giảm
Sau khi sàng lọc hơn 1000 đột biến, các nhà nghiên cứu đã xác định được sáu ứng cử viên: Mut11 (K180E), Mut12 (S228F), Mut13 (G238L), Mut14 (A70Q), Mut15 (A383H) và Mut16 (I743L). Tổng sản lượng RNA của cả sáu đột biến không khác biệt đáng kể so với kiểu hoang dã, cho thấy hiệu quả phiên mã tổng thể tương đương. Như mong đợi, hàm lượng dsRNA của Mut11 và Mut14 thấp hơn đáng kể so với kiểu hoang dã(Hình 4).
Hình 4. Sàng lọc tấm vi mô và đánh giá biến thể
Mut17 từ việc xáo trộn DNA tạo ra ít dsRNA hơn
Để tối ưu hóa T7 RNAP hơn nữa, bốn biến thể có hàm lượng dsRNA thấp nhưng vẫn đáp ứng được yêu cầu sản xuất đã được chọn.Sau đó, các nhà nghiên cứu đã xây dựng một thư viện xáo trộn DNA và sàng lọc bằng các tấm vi mô, xác định một biến thể biểu hiện sản xuất dsRNA thấp hơn so với T7 RNAP gốc của nó, được đặt tên là Mut17 (A70Q/F162S/K180E). Sau đó, họ phân tích các sản phẩm phiên mã của Mut17 và các biến thể gốc của nó (Mut14, Mut11 và Mut7). Như thể hiện trong Hình 5, cả bốn biến thể đều biểu hiện sự giảm đáng kể trong sản xuất dsRNA trong quá trình phiên mã so với kiểu hoang dã. Đáng chú ý, Mut17 cho thấy hàm lượng dsRNA thấp hơn đáng kể chỉ 1,80% và thấp tới 0,007 ng/μg trong hệ thống dung môi sàng lọc.
Hình 5. Hàm lượng dsRNA của Mut17 và các đột biến của cha mẹ nó
Tính sinh miễn dịch của sản phẩm IVT từ đột biến thấp hơn đáng kể so với kiểu hoang dã.
Kế tiếp, Chúng tôi đã đánh giá khả năng sinh miễn dịch của các sản phẩm IVT ở bệnh RA ở chuộtW264.7 tế bào. Như thể hiện trong Hình 2A và 2B, mức mRNA và protein IFN-β đã giảm ở RAW264.7 tế bào được chuyển gen bằng mRNA do đột biến sản xuất so với tế bào kiểu hoang dã, cho thấy mRNA được tổng hợp bởi T7 RNAP kiểu hoang dã gây ra phản ứng miễn dịch mạnh nhất, trong khi mRNA từ đột biến cho thấy phản ứng giảm đáng kể. Cụ thể, mRNA IFN-β của các tế bào được xử lý bằng RNA Mut11 chỉ bằng 9,7% so với các tế bào được xử lý kiểu hoang dã và protein của nó là 12,93 pg/mL. Hơn nữa, biểu hiện của EGFP không cho thấy sự khác biệt đáng kể về số lượng hoặc chất lượng giữa các mRNA được tạo ra bởi các RNAP T7 khác nhau (Hình 6C), đáp ứng các yêu cầu cho các ứng dụng công nghiệp.
Hình 6. Phản ứng IFN-β và biểu hiện EGFP trong tế bào động vật có vú
Hoạt động RDRP và terminal transferase của đột biến này rất đáng lo ngại.chúng tôir hơn so với loại hoang dã.
Để nghiên cứu tác động của đột biến đến việc giảm dsRNA, các nhà nghiên cứu được tiến hành trong các nghiên cứu in silico trên tất cả các đột biến này. Kết quả cho thấy dấu hiệu rõ ràng về hoạt động RDRP giảm ở các biến thể, vì chúng cho thấy xu hướng giảm sử dụng RNA làm khuôn mẫu. Tương tự như vậy, điều này có thể đã tác động đến hoạt động transferase đầu cuối của T7 RNAP. Như thể hiện trong Nhân vật 7, ở các nồng độ khác nhau, cả 4 biến thể đều biểu hiện giá trị huỳnh quang thấp hơn 50% so với kiểu hoang dã.
Sau đó, một xét nghiệm dị hợp 3'-end được sử dụng để mô tả hoạt động chuyển giao đầu cuối của T7 RNAP. Khi tập trung vào tỷ lệ RNA với n>0, phản ánh hoạt động transferase đầu cuối, các nhà nghiên cứu phát hiện ra rằng các RNA này chiếm 82,94% ở dạng hoang dã, trong khi các đột biến biểu hiện các tỷ lệ phần trăm sau: Mut11 (70,29%), Mut7 (67,88%), Mut14 (63,31%) và Mut17 (55,62%) (Nhân vật 8). Điều quan trọng là những tỷ lệ phần trăm này rất phù hợp với sự phong phú của dsRNA trong các sản phẩm (Hình 5). Những kết quả này chỉ ra sự giảm đáng kể hoạt động của terminal transferase ở các đột biến, cùng với sự giảm hoạt động của RDRP, góp phần làm giảm dsRNA.Cụ thể, hoạt động của terminal transferase có thể đóng vai trò quan trọng hơn, bằng chứng là sự tích lũy thấp nhất của RNA n>0 được quan sát thấy ở Mut17, cũng thể hiện sản xuất dsRNA thấp nhất. (Hình 5 và Hình 8).
Nhân vật 7. Hoạt động RDRP tương đối
Nhân vật 8. Sự không đồng nhất ở đầu 3' của sản phẩm RNA
Phần kết luận
Nghiên cứu này cung cấp một phương pháp mạnh mẽ để xác định các đột biến có hàm lượng dsRNA giảm và phân lập thành công nhiều đột biến dsRNA có hoạt động RNA polymerase phụ thuộc RNA và terminal transferase giảm. Nó củng cố đáng kể việc xác nhận tính an toàn và hiệu quả không thể thiếu đối với liệu pháp mRNA, nhấn mạnh ý nghĩa sâu sắc của nó đối với việc thúc đẩy các ứng dụng vắc-xin mRNA và liệu pháp gen.
Đồng thời, công ty mẹ
Thông tin đặt hàng
Sau đây là các sản phẩm tiêu biểu được cung cấp bởi