Giải trình tự thế hệ tiếp theo (NGS) đã cho thấy triển vọng ứng dụng nghiên cứu khoa học và lâm sàng cực kỳ rộng rãi trong các lĩnh vực như phát hiện tác nhân gây bệnh, phát hiện đột biến khối u và di truyền sinh sản do độ nhạy phát hiện cao, độ đặc hiệu mạnh và khả năng thực hiện cả phát hiện định tính và định lượng. Xây dựng thư viện, là một bước cốt lõi trong NGS, ảnh hưởng trực tiếp đến chất lượng giải trình tự. Dựa trên hướng dẫn đánh giá đăng ký sản phẩm chẩn đoán in - vitro (IVD), cần cung cấp dữ liệu nghiên cứu của nguyên liệu chính. Cần tiến hành phân tích và xác minh toàn diện bằng cách kết hợp các yếu tố như thông tin cơ bản, chỉ số tham số và nguồn cung cấp nguyên liệu để xác định nguồn nguyên liệu phù hợp nhất. Quá trình xây dựng thư viện DNA và RNA thông thường chủ yếu bao gồm các bước chính như tổng hợp cDNA, phân mảnh DNA, gắn bộ điều hợp và khuếch đại thư viện, Các bước khác nhau chứa nhiều loại enzyme nguyên liệu thô. Việc sàng lọc các enzyme nguyên liệu thô kéo dài chu kỳ nghiên cứu. Trên cơ sở này, các sản phẩm mô-đun xây dựng thư viện đơn giản và tiết kiệm chi phí đã trở thành sự lựa chọn mới cho việc phát triển các sản phẩm IVD.
Hình 1. Quy trình xây dựng thư viện DNA thông thường (trái) và quy trình xây dựng thư viện RNA (phải), lấy nền tảng Illumina làm ví dụ
Tổng hợp phiên mã ngược là phần cốt lõi của RNA-Seq, Mới loại cao hiệu quả phiên mã ngược, tích hợp nhiều chức năng như độ nhạy cao, cao năng suất của cDNA và khả năng tương thích với các khuôn mẫu có cấu trúc phức tạp là một điểm nóng nghiên cứu. Nền tảng sửa đổi enzyme ZymeEditor™ của
Hình 2. Hiệu suất của 13488ES được áp dụng trong RNA-seq
Do độ dài đọc ngắn của nền tảng giải trình tự, DNA cần được phân mảnh ngẫu nhiên trước khi xây dựng thư viện. Ở giai đoạn đầu, quá trình phân mảnh enzyme rất khó khăn do các vấn đề về tính đồng nhất và độ lệch.
Hình 3. Tác động phân mảnh của các enzyme phân mảnh DNA khác nhau: enzyme phân mảnh hoạt động mạnh (trái) và enzyme phân mảnh hoạt động nhẹ (phải)
Tỷ lệ chuyển đổi thư viện là một chỉ số quan trọng để đánh giá chất lượng thư viện. Tỷ lệ chuyển đổi thư viện cao ở một mức độ nào đó có nghĩa là thư viện phong phú hơn và dữ liệu giải trình tự đồng nhất hơn. T4 DNA ligase thông thường tập trung vào việc tối ưu hóa quá trình gắn kết hiệu quả cao, nhưng các đoạn dễ bị tự gắn kết, làm giảm tỷ lệ chuyển đổi thư viện và ảnh hưởng đến độ phong phú của thư viện và chất lượng giải trình tự. Các
Hình 4. Phân tích độ ổn định nhiệt và dư lượng liên kết của 12996ES
Các enzyme khuếch đại PCR đều cần thiết trong phương pháp chuẩn bị thư viện NGS. Hầu hết các DNA polymerase có độ trung thực cao đều có hoạt động polymerase 5'→3' và hoạt động exonuclease 3'→5', Nó có thể tổng hợp DNA theo hướng 5'→3' trong khi sửa chữa các bazơ được kết hợp sai, Vì vậy, nó có thể khuếch đại các đoạn DNA một cách nhanh chóng và với độ chính xác cao. Nhưng ít enzyme nào được thiết kế đặc biệt cho NGS, Không có nhiều sản phẩm khuếch đại thư viện hiệu quả, chính xác, đặc hiệu và có khả năng khuếch đại các mục tiêu có kích thước và hàm lượng GC khác nhau mà không bị sai lệch, đồng thời có khả năng trộn trước các đoạn mồi.
Hình 5. Phân tích tỷ lệ lỗi khuếch đại và độ ổn định của 12980ES
Ngoài loạt sản phẩm mô-đun xây dựng thư viện NGS nêu trên, Chúng tôi cũng cung cấp các sản phẩm enzyme thô một cửa, để đáp ứng nhu cầu kết hợp của nhiều khách hàng khác nhau.
| Danh mục sản phẩm | Tên sản phẩm | Số mèo | Nhận xét |
| Tổng hợp cDNA hiệu quả | Hifair™ Phiên mã ngược siêu đẳng (200 U/μL) | 14604ES | Enzym phiên mã ngược |
| Hieff NGS™ Bộ tổng hợp ds-cDNA | 13488ES | Mô-đun tổng hợp cDNA | |
| ADN Phân mảnh & Sửa chữa cuối & Đuôi A | Hieff™ Smerase | 12907ES | Phân mảnh DNA |
| Mô-đun phân mảnh DNA Hieff NGS™ OnePot Pro (sửa chữa cuối và gắn đuôi dA cộng thêm) | 12619ES | ADN Mô-đun phân mảnh & sửa chữa cuối & đuôi A | |
| Sửa chữa & A-Tailling | Mô-đun sửa chữa đầu cuối/dA-Tailing Hieff NGS® tốc độ nhanh | 12608ES | Mô-đun sửa chữa cuối và đuôi A |
| Thắt ống dẫn | 10299ES | T4 ADN ligase | |
| khuếch đại thư viện | 2× Bộ khuếch đại Ultima HF | 13344ES | Enzym có độ trung thực cao |